Questo metodo può aiutare ad affrontare le domande chiave in biologia, come il modo in cui diversi tipi di cellule vengono generati e organizzati in strutture di ordine superiore con funzioni specifiche. Il principale vantaggio di questa tecnica è che facilita un'efficiente purificazione delle cellule presenti a bassa abbondanza nel sistema visivo Drosophila per l'analisi trascritomica e genomica. Martedì della settimana sei del protocollo, 45 minuti prima delle dissezioni, recuperare una fiala di polvere di papaina da quattro gradi Celsius e incubarla a temperatura ambiente.
Successivamente, mettere da parte Complete Schneider's Medium, o CSM, in un tubo Eppendorf a temperatura ambiente da aggiungere alla polvere di papaina in seguito. Da cinque a dieci minuti prima delle dissezioni, utilizzare una siringa per aggiungere il CSM a temperatura ambiente al flaconcino di papaina direttamente attraverso il tappo a una concentrazione di 100 unità per millilitro. Per mescolare, invertire prima il flaconcino per catturare qualsiasi polvere bloccata all'interno del cappuccio e quindi pipettare il contenuto su e giù.
Dopo aver mescolato i reagenti, portare l'acqua fino a 37 gradi Celsius in un becher in un bagno d'acqua. Quindi posizionare il flaconcino nel becher per 30 minuti per attivare la papaina e assicurarsi che il flaconcino non galleggia. Mentre la papaina sta incubando, recuperare un'aliquota di miscela enzimatica proteolitica dal congelatore e incubarla a temperatura ambiente.
Dopo 30 minuti di attivazione, incubare la papaina a temperatura ambiente. Martedì della sei settimana, sezionare il cervello della pupilla in scena nel CSM freddo con forcep pulite. Sezionare il maggior numero possibile di cervelli in 10 minuti e mettere in comune il cervello in una nuova goccia di CSM freddo.
Tagliare i lobi ottici pizzicando alla giunzione del lobo ottico e del cervello centrale. Quindi, aggiungere i lobi sul fondo di un microtubo contenente 500 microlitri di 1x RS. Un microtubo per il tessuto sperimentale e uno per il tessuto di controllo negativo. Tieni i tubi sul ghiaccio.
Seziona il maggior numero possibile di lobi in un'ora. Mettere in comune i lobi ottici sezionati in un unico microtubo per eliminare la perdita di tessuto durante il trasferimento tra microtubi. Rimuovere con cura il 1x RS dal microtubo con i lobi ottici sezionati utilizzando una pipetta P200, lasciando una soluzione sufficiente per coprire i lobi.
Aggiungere con cura 500 microlitri da 1x RS sul lato del tubo. Lasciare che i lobi si sistemino sul fondo del tubo, quindi pipettare fino a 200 microlitri. Espellere il mix, osservare i lobi in movimento e lasciare che i lobi si sistemino di nuovo.
Per i due campioni, aliquote 600 microlitri di papaina attivata a temperatura ambiente in un microtubo. Creare quindi la soluzione di dissociazione. Aggiungere 4,2 microlitri di miscela enzimatica proteolitica a temperatura ambiente in 600 microlitri di soluzione di papaina per ottenere una concentrazione finale di 0,18 WU per millilitro e mescolare la soluzione tubazione su e giù.
Quindi rimuovere con cura il 1x RS da ogni campione e aggiungere 300 microlitri di soluzione di dissociazione ai lobi. Incubare i campioni a 25 gradi Celsius. 1.000 giri/min per 15 minuti in un ThermoMixer a microtubo.
Nei punti di tempo di 5 e 10 minuti, ferma thermomixer e lascia che i lobi sprofondno nella parte inferiore del microtubo. Pipettare fino a 200 microlitri della soluzione e mescolare. Dopo l'incubazione di 15 minuti, attendere che i lobi si sistemino sul fondo e rimuovere con cura la soluzione di dissociazione dai lobi senza disturbare i lobi.
Lavare i lobi due volte con 1x RS. Aggiungere con cura 500 microlitri da 1x RS senza disturbare i lobi. Quindi pipettare con cura 200 microlitri ed espellere delicatamente la soluzione. Lasciare che i lobi affondino sul fondo e si ripetano.
Successivamente, lavare ogni campione due volte con 500 microlitri di CSM. Rimuovere con cura il CSM e aggiungere altri 200 microlitri di CSM al tubo. Utilizzando una pipetta P200, interrompere il tessuto tubando su e giù senza schiumare fino a quando la soluzione non è omogenea.
Utilizzando una pipetta P200, filtrare la sospensione cellulare attraverso un tappo a rete da 30 micrometri in un tubo fax da 5 millilitri sul ghiaccio. E assicurati che l'intera sospensione sia attraversata. Aggiungere 500 microlitri di CSM per risciacquare il microtubo di dissociazione.
E filtrare la soluzione nel tubo fax. Infine, togliere con cura il tappo del tubo fax. Raccogliere la soluzione sotto il filtro a rete con un P200 e aggiungerla al resto della sospensione nel tubo fax.
Microscopia confocale di lobi immuno macchiati con anticorpi specifici contro DSRed e GFP, nonché l'anticorpo 24B10 come riferimento per i neuropile lamina e midollo hanno confermato che L3 è l'unico tipo di cellula etichettato sia da DsRed che da GFP nel lobo ottico. Sono stati registrati i dati dei fatti di 100.000 eventi, di cui il 29,9% di tutti gli eventi sono potenziali singoletti. Dopo che i farsa nelle cellule con dimensioni diverse sono stati recintati in base alla granularità e alle dimensioni, le restanti singole cellule, i neuroni L3, sono apparse come ammassi stretti in P1, che era ben separato dalle cellule di sfondo.
Seguendo questa procedura, altri metodi come RNA-seq o ATAC-seq possono essere eseguiti per affrontare questioni biologiche attraverso l'analisi dell'espressione genica o dell'organizzazione della cromatina, rispettivamente. Questa tecnica migliora notevolmente la capacità dei ricercatori di esplorare i meccanismi genetici alla base dello sviluppo e della funzione di tessuti complessi utilizzando il sistema visivo Drosophila come modello.
