Questo lavoro è stato finanziato dalla National Science Foundation per IOS-1256565 e IOS-1557638 a AWS. Ringraziamo Patricia Wittkopp e tre anonimi recensori per i loro commenti utili su una versione precedente di questo articolo.

1. Montaggio del campione NOTA: Conservare le mosche morte in etanolo al 70% in acqua prima dell&#39;immagine. <ol><li> Versare 10 ml di agar 1,25% agar disciolto in acqua bollente in un piatto di Petri da 60 mm x 15 mm e lasciarlo impostare. </li><li> Sotto un microscopio di dissezione, utilizzare una coppia di pinze a punta fine per fare una scanalatura di 20 mm, una scanalatura profonda di 2 mm di profondità da 1 mm sulla superficie del gel. Utilizzando pinze fine, incorporare il lato ventrale di un mosca adulto nella scanalatura, con il lato dorsale della mosca che proietta sopra il gel. NOTA: L&#39;allentamento del gel consente un semplice riposizionamento senza danneggiare il campione. La stessa scanalatura può essere usata per più esemplari, anche se diventa sporca, spezzata e inutilizzabile nel tempo. L&#39;utente può quindi eseguire un&#39;altra scanalatura nello stesso gel. Ogni piastra può essere usata per immagini ~ 200 mosche. </li><li> Completamente coprire il campione in etanolo al 70% in acqua per ridurre le riflessioni della luce dalla cuticola cerosa e per evitare danni alle ali duranteManipolazione dei campioni. </li></ol> 2. Impostazione del microscopio NOTA: Le immagini vengono acquisite utilizzando un campo di dissezione, una base di luce trasmessa, una fotocamera digitale e una fonte di luce fredda a gooseneck collegata ad un computer che esegue il software di acquisizione di immagini. Le istruzioni del software sono specifiche di Micro-Manager v1.4.20 44 , che è un software open source che incorpora ImageJ 45 . <ol><li> Accendere il microscopio, la fotocamera digitale, la fonte di luce fredda a doppio fascio e il computer. </li><li> Esegui il software di acquisizione delle immagini per aprire una finestra Micro-Manager e una finestra ImageJ. Nella finestra ImageJ fare clic su &quot;Image&quot;&gt; &quot;Type&quot;&gt; &quot;8-Bit&quot; per impostare tutte le immagini come 8 bit. Fai clic su &quot;live&quot; nella finestra Micro-Manager per aprire una finestra &quot;Snap / Live&quot; che mostra un&#39;anteprima in tempo reale dalla fotocamera. <ol><li> Massimizza la dimensione della finestra &quot;Snap / Live&quot; se nesario. Selezionare &quot;Scala di grigi&quot; nel menu &quot;Modalità di visualizzazione&quot; a discesa nella scheda &quot;Contrasto&quot; della finestra Micro-Manager. </li></ol></li><li> Accendere la fonte di luce fredda fino alla sua massima intensità e posizionare le punte di ciascun collo a circa 120 mm dalla fase, una sulla sinistra e una sulla destra. NOTA: Gli utenti possono anche utilizzare un illuminatore anulare, anche se questo può generare un anello di luce riflessa attorno all&#39;addome mosca. </li><li> Impostare manualmente l&#39;ingrandimento del microscopio a 60x in modo che il campo visivo cattura una superficie di circa 3 mm sul palco. </li><li> Posizionare un micrometro di fase a 2 mm sul palco (passando lo sfondo a bianco, se necessario). Mentre guardi l&#39;anteprima dal vivo, concentrarsi sul micrometro di fase e regolare l&#39;esposizione nella finestra Micro-Manager immettendo il tempo di esposizione in ms nella casella &quot;Esposizione&quot;. </li><li> Per calibrare la fotocamera spazialmente, selezionare lo strumento &quot;linea retta&quot; in tLui ImageJ finestra e disegnare una linea la lunghezza del micrometro di fase. Nella finestra ImageJ fare clic su &quot;Analizza&quot;&gt; &quot;Imposta scala&quot; per aprire la finestra &quot;Imposta scala&quot;, inserire la lunghezza del micrometro in μm nella casella &quot;Distanza nota&quot; e immettere &quot;μm&quot; nell&#39;unità di &quot;lunghezza&quot; scatola. <ol><li> Vedere che la finestra &quot;Imposta scala&quot; visualizza la scala in &quot;pixel / μm&quot;. Prendi nota della scala e fai clic su &quot;OK&quot;. </li></ol></li><li> Nella finestra &quot;Snap / Live&quot;, fare clic su &quot;Stop&quot; e poi su &quot;Snap&quot; per catturare un&#39;immagine del micrometro di fase. </li><li> Salvare l&#39;immagine come una TIFF in scala di grigi a 8 bit per garantire la possibilità di calibrare spazialmente le immagini, se necessario. Nella finestra ImageJ fare clic su &quot;File&quot;&gt; &quot;Salva con nome&quot;&gt; &quot;Tiff ...&quot; Specificare dove salvare il file nel file browser, denominare il file e fare clic su &quot;Salva&quot;. </li><li> Commutare il palco in nero e postoUn piatto di Petri che tiene una mosca montata in agar (punti 1.1-1.2) sul palco. </li><li> Guardate attraverso il microscopio e posizionate la mosca per assicurare che la linea mediana dorsale sia dritta per vedere meglio il pattern di pigmentazione. Spostare le ali e le appendici per assicurare che la vista dell&#39;addome non sia ostacolata. Se la cuticola pigmentata (a2-a5) non è visibile, estrarre lateralmente l&#39;addome fino a quando non è (anche se l&#39;addome delle mosche è conservato in etanolo al 70% in acqua, quindi questo non è di solito necessario). NOTA: quando si posiziona la mosca, potrebbe essere necessario utilizzare un ingrandimento inferiore (20X). L&#39;ingrandimento deve essere restituito a 60X prima di procedere. </li><li> Messa a fuoco manuale sull&#39;addome dorsale della mosca. Regolare manualmente le punte della sorgente luminosa per ridurre al minimo le ombre e la riflessione sull&#39;addome dorsale. </li><li> Guardando l&#39;anteprima dal vivo sullo schermo del computer e utilizzando l&#39;istogramma del valore di pixel nella scheda &quot;Contrasto&quot; della finestra Micro-Manager,Regolare l&#39;esposizione come descritto nel punto 2.4 per massimizzare l&#39;intervallo di valori dei pixel dell&#39;immagine di anteprima. </li><li> Rimuovere il piatto di mosca e Petri e sostituirli con un LED (uscita spettrale di 430-660 nm) collegato ad un contatore di tensione, centrato nel campo visivo nella stessa posizione del mosca. Utilizzare il misuratore di tensione e LED come misuratore di luce 46 e registrare la tensione generata dalla luce che colpisce il LED (~ 125 mV). NOTA: il LED e il contatore di tensione vengono utilizzati per garantire che i livelli di luce siano costanti in sessioni di imaging multiple in un singolo esperimento. </li><li> Per la durata dell&#39;esperimento, non modificare ulteriormente la posizione o l&#39;intensità della sorgente luminosa, l&#39;ingrandimento del microscopio o l&#39;esposizione della fotocamera. </li></ol> 3. Esemplare Imaging <ol><li> Posizionare un piatto di Petri in possesso di una mosca montata in agar (punti 1.1-1.3) sullo stadio del microscopio nero. Regolare la posizione del mosca in modo che il terzo e quattroH segmenti addominali sono visibili e la linea mediana dorsale è dritta, come descritto al passaggio 2.9. Assicurarsi che l&#39;ingrandimento sia a 60x prima di procedere. </li><li> Messa a fuoco manuale il microscopio in modo che il terzo e il quarto terzitomi addominali dorsali siano a fuoco. Utilizzare il software di acquisizione di immagini per acquisire un&#39;immagine come un TIFF in scala di grigi a 8 bit, come descritto nel passaggio 2.6. NOTA: L&#39;immagine può essere acquisita a colori e successivamente convertita in scala di grigi per l&#39;analisi. </li><li> Salvare l&#39;immagine come &quot;SESH000_sampleID.tiff&quot;, come descritto nel punto 2.7. NOTA: qui [SESH] è costante, [000] è il numero della sessione ed è variabile ma deve essere di tre cifre e [sampleID] è qualunque cosa desideri, anche se non deve contenere caratteri di sottolineatura (_) aggiuntivi Deve essere di lunghezza costante. [SampleID] dovrebbe includere dettagli sui fattori utilizzati nell&#39;analisi dei dati di pigmentazione ( ad esempio, temperatura o linea di origine), separati da un carattere non-alfabetiCarattere cal, come un trattino (-). Ciò consente a questi fattori di essere facilmente analizzati da [sampleID] usando un software statistico standard. </li><li> Rimuovere il piatto di Petri dal palco e sostituire la mosca con il prossimo campione. Ripetere i passaggi 3.1-3.3 finché tutti gli esemplari non sono stati riprodotti, senza aggiustare ulteriormente i livelli di illuminazione, l&#39;ingrandimento o l&#39;esposizione. </li></ol> 4. Imaging in diverse sessioni <ol><li> Se le immagini devono essere assunte in più sessioni, mantenere l&#39;intensità della luce, l&#39;esposizione e l&#39;ingrandimento in tutte le sessioni. All&#39;inizio di ogni sessione, controllare la calibrazione spaziale della fotocamera (punto 2.4) e l&#39;intensità della luce sul palco (misurata con il LED / tensione, punto 2.12). </li><li> Cattura e salva un&#39;immagine del micrometro di fase (passaggi 2.5-2.7) per garantire la possibilità di calibrare spazialmente le immagini, se necessario. </li><li> Utilizzare almeno 15 esemplari di controllo e riesaminarli in modo casuale in ogni sessione allo alloW per la rilevazione e l&#39;eliminazione degli effetti di sessione. Assicurarsi che i campioni di controllo duplicati tra le sessioni hanno lo stesso [sampleID] ma diversi [SESH000]. NOTA: i campioni di controllo sono le mosche raccolte, memorizzate e montate in modo identico a campioni sperimentali, ma vengono riprogettati in sessioni. Il numero preciso degli esemplari di controllo dipenderà dall&#39;installazione sperimentale dell&#39;utente. Vedere la discussione per ulteriori dettagli. </li></ol> 5. Analisi delle immagini NOTA: L&#39;analisi delle immagini è condotta in ImageJ 45 e utilizza la macro &quot;Measurement of Pigmentation.ijm&quot;, fornita come file aggiuntivo. <ol><li> Posiziona tutte le immagini da analizzare nella stessa cartella. </li><li> Avviare ImageJ e eseguire la macro &quot;Measurement of Pigmentation.ijm&quot; facendo clic su &quot;Plugins&quot;&gt; &quot;Macro&quot;&gt; &quot;Esegui&quot;, selezionando &quot;Measurement of Pigmentation.ijm&quot; nel browser del file e facendo clic su &quot;Aperto.&quot; NOTA: tutti i passaggi successivi sono all&#39;interno della macro. Ogni passo è un comando macro singolo. </li><li> Si noti che viene aperta una finestra di dialogo &quot;Action Required&quot; che indica &quot;Scegli la cartella in cui sono memorizzate le immagini&quot;. Fai clic su &quot;OK&quot; e utilizza il browser file per selezionare la cartella contenente le immagini e quindi fare clic su &quot;scegli&quot;. </li><li> Si noti che una finestra di dialogo &quot;Azione richiesta&quot; verrà aperta, indicando &quot;Scegli la cartella in cui si desidera memorizzare i dati&quot;. Fare clic su &quot;OK&quot; e utilizzare il browser file per selezionare la cartella desiderata per salvare i profili di pigmentazione. Fai clic su &quot;scegli&quot;. </li><li> Notare che verrà aperta una finestra di dialogo che chiede &quot;quanti caratteri nel tuo ID campione&quot;? Nella casella di immissione dati, immettere il numero di caratteri in [SampleID], come specificato al passaggio 3.3, e fare clic su &quot;OK&quot;. </li><li> Notare che verrà aperta una finestra di dialogo che chiede &quot;Quanto è largo il ROI?&quot; Nella casella di immissione dati, immettere la larghezza dei pixel dell&#39;anteriore-Striscia posteriore lungo la quale deve essere letto il profilo di pigmentazione (rettangolo verde, figura 1G , figura 2A e 2A &#39;). Fare clic su &quot;OK&quot;; Il valore predefinito è di 20 pixel. NOTA: Il profilo di pigmentazione viene letto attraverso una striscia di cuticola, piuttosto che una linea, per ridurre il rumore dovuto a peli e setole. La larghezza di questa striscia dipenderà dalla risoluzione dell&#39;immagine, ma dovrebbe essere ~ 1/20 della larghezza dell&#39;addome, in pixel. </li><li> Si noti che la macro apre l&#39;immagine del primo volo e una finestra di dialogo chiede se misurare la mosca corrente (fare clic su &quot;Sì&quot;) per passare alla prossima mosca (fare clic su &quot;No&quot;) oppure per uscire dalla finestra Macro (fare clic su &quot;Annulla&quot;). </li><li> Si noti che verrà aperta una finestra di dialogo che indica &quot;Definire la linea mediana dell&#39;addome dorsale, da ANTERIOR a POSTERIOR&quot;. Lo strumento &quot;lineare&quot; sarà già selezionato. Disegnare una linea dall&#39;anteriore al posteriorePer definire la linea mediana dell&#39;addome dorsale. Fare clic su &quot;OK&quot;; Vedi figura 2A e 2A &#39;, linea gialla. NOTA: viene utilizzato per riorientare l&#39;immagine in modo che la linea mediana dorsale sia orizzontalmente sullo schermo, con l&#39;anteriore a sinistra, facendo più facilmente i passaggi successivi. </li><li> Si noti che verrà aperta una finestra di dialogo che indica &quot;Definire il bordo POSTERIOR di Tergite 4 appena dietro la fascia di pigmento&quot;. Lo strumento &quot;lineare&quot; sarà già selezionato. Disegnare una linea dal bordo della mediana posteriore al bordo laterale destro, in modo tale che il centro della linea (contrassegnato da un quadrato bianco) sia posteriormente posizionato sul bordo posteriore della banda di pigmento (cuticola a5). Fai clic su &quot;OK&quot;; Vedere la Figura 2A e 2A &#39;, linea magenta. NOTA: lo script R rileverà automaticamente il bordo posteriore della fascia di pigmento dal profilo di pigmentazione. </li><li> Si noti una finestra di dialogoSi apre la scritta &quot;Definire il bordo ANTERIOR di Tergite 4 al bordo anteriore della cuticola pigmentata (a2)&quot;. Lo strumento &quot;lineare&quot; sarà già selezionato. Disegnare una linea dal bordo mediano anteriore al bordo laterale destro, in modo che il centro della linea (contrassegnato da un quadrato bianco) si trovi sul bordo anteriore della cuticola pigmentata (cuticola a2). Fai clic su &quot;OK&quot;; Vedere la Figura 2A e 2A &#39; , linea ciano. NOTA: lo script R definirà questo punto come il bordo anteriore della cuticola pigmentata del tergito. Sull&#39;immagine, la macro mostrerà la regione di interesse (ROI) lungo la quale viene letto il profilo di pigmentazione (rettangolo verde, figura 2A e 2A &#39;, ingrandita nella figura 2B e 2B &#39;). La macro aprirà anche una seconda finestra che mostra il profilo di pigmentazione per il ROI ( fig<html> E 2C e 2C &#39;), dove l&#39;asse x è la posizione, espressa come numero di pixel dal bordo posteriore del profilo e l&#39;asse y è il valore medio di pixel in ogni posizione. </li><li> Visualizza le trame del profilo di pigmentazione che verrà aperta dalla macro. Se necessario, fare clic su &quot;Live&quot; nella finestra del profilo per regolare la posizione del ROI in modo che non includa strutture ( es. Setole) che influenzerebbero il profilo di pigmentazione. Una volta che il profilo è soddisfacente, fai clic su &quot;OK&quot;. </li><li> Ripetere i passaggi 5.8-5.11 per Tergite 3. NOTA: La macro esporta i profili di pigmentazione come due file CSV, ognuno denominato &quot;SESH000_samplename_TX_profile.csv&quot;, dove [SESH000_samplename] è il nome dell&#39;immagine e [TX] sia T3 o T4 per il terzo e il quarto tergit. </li><li> Notare che la macro apre l&#39;immagine successiva. Ripetere i passaggi 5.7-5.13 finché tutte le immagini sono state analizzate. </li></ol>Jove_title &quot;&gt; 6. Preprocesso dei dati, analisi e correzione della sessione NOTA: Tutte le analisi dei dati sono condotte in R 47 e usano lo script &quot;Analisi di pigmento.R&quot; fornito. Di seguito, &quot;L ...&quot; indica quali linee di script da eseguire per ciascuna parte dell&#39;analisi. Vedere le informazioni supplementari per ulteriori dettagli sull&#39;esecuzione dell&#39;analisi. <ol><li> Modificare lo script R per impostare la directory di lavoro (L6) e definire il percorso di file nella cartella contenente i profili the.csv (L11). </li><li> Esegui L13-15 per generare un elenco dei profili di pigmentazione memorizzati nella cartella del profilo. </li><li> Caricare e gestire le funzioni &quot;reader&quot; e &quot;addPrimaryKey&quot; (L17-41) per leggere i profili in un singolo frame di dati. </li><li> Modificare lo script a L43 per specificare la calibrazione spaziale delle immagini in μm / pixel, come determinato nel passaggio 2.5. </li><li> Caricare e eseguire il &quot;regolazione&quot;(L46-58) per convertire la posizione del profilo (asse x, figura 2C e 2C &#39;) dai pixel-da-posteriore-edge-of-ROI a μm-from-front-edge-of-ROI e (0 = nero, 255 = bianco) al valore di pigmento (0 = nessun pigmento, 255 = pigmento massimo), il valore del profilo (asse y, figura 2C e 2C &#39;). </li><li> Caricare ed eseguire la funzione &quot;spline.der.er&quot; (L60-71) per generare la spline cubica dei profili di pigmentazione e dei suoi primi e secondi derivati ​​( Figura 2D -2F e 2D &#39;- 2F &#39;). </li><li> Caricare ed eseguire le funzioni &quot;coord&quot; e &quot;assmbly.coord&quot; (L74-163), innanzitutto per estrarre la posizione dei bordi posteriori (T3) e anteriori (T 2 ) della fascia di pigmento ( figura 2D e 2D &#39;;) E il bordo posteriore della cuticola a2 (T1, Figura 2D e 2D &#39;) e quindi estrarre rispettivamente i valori di pigmentazione massima (P max ) e minima (P min ), assunti rispettivamente in T 3 e T 1 . NOTA: Il bordo anteriore della cuticola a2 è già stato definito nel passaggio 5.9. </li><li> Facoltativo: caricare ed eseguire la funzione &quot;chek&quot; (L165-175) per verificare se la funzione &quot;coordina&quot; identifica correttamente le posizioni T 1-3 per un profilo di pigmentazione selezionato a caso. </li><li> Caricare ed eseguire le funzioni di indice e metriche (L178-193) per generare una tabella dati con le intestazioni &quot;Session&quot;, &quot;Sample&quot;, &quot;Tergite&quot;, &quot;id&quot; (una concatenazione di Sample e Tergite), &quot; Pmax &quot; &quot;P min &quot;, &quot;W band &quot; (larghezza della fascia pigmentata, = T3 - T2) e &quot;W tergite &quot; (larghezza del pigmento cUticoli a2-a5, = T3). </li><li> Caricare e eseguire la funzione &quot;correzione&quot; (L196-234) per generare una tabella dati che corregge P max e P min per eventuali fattori di fastidio derivanti da effetti di sessione. Utilizzare l&#39;aumento medio (o diminuzione) di P max o P min dai campioni di controllo riprogettati in sessioni adiacenti temporanee. </li></ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Questa metodologia consente l&#39;acquisizione precisa, rapida e ripetibile di dati di pigmentazione in una forma quantitativa adatta a più analisi a valle. Il metodo è stato utilizzato per acquisire dati sull&#39;effetto della temperatura sulla pigmentazione addominale in una linea isogenica di mosche. Tuttavia, la metodologia potrebbe essere utilizzata negli studi di avanzamento genetico per identificare i geni che stanno alla base delle differenze di pigmentazione tra individui, popolazioni o specie o studi reverse...

La pigmentazione mostra enormi variazioni fenotipiche tra specie, popolazioni e individui, e anche all&#39;interno di individui durante l&#39;ontogenesi 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Sebbene ci siano innumerevoli studi di pigmentazione in un&#39;ampia varietà di animali, la pigmentazione è stata forse meglio studiata in Drosophila melanogaster , dove è stato utilizzato il pieno potere della genetica molecolare per chiarire i meccanismi di sviluppo e fisiologici che regolano la pigmentazione e come questi meccanismi evolvono 1 , 6 . Molti sono noti sui geni che regolano la sintesi biochimica dei pigmenti in D. melanogaster 7 , 8 ei geni che controllano la temporale e la spazialità diStribuzione di questa biosintesi 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Inoltre, la mappatura genetica ha individuato i siti genetici che sottendono le differenze intra- e interspecifiche nella pigmentazione in D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 . Sono stati esplorati anche i rapporti tra la pigmentazione e le caratteristiche pleiotropiche, come il comportamento 18 , 19 e l&#39;immunità 19 , 20 , così come il significato adattativo dei modelli di pigmentazione 15 , 21 , 22 . Come tale, la pigmentazione in D. melanogaster è emersa come un potente ma semplice mOdel per lo sviluppo e l&#39;evoluzione di fenotipi complessi. La pigmentazione nell&#39;adulto D. melanogaster è caratterizzata da pattern distinti di melanizzazione sul corpo, in particolare sulle ali e sul torace dorsale e sull&#39;addome. È la pigmentazione di ogni piastra cuticolare (tergita) sull&#39;addoma dorsale, tuttavia, che ha ricevuto la più attenzione. C&#39;è una notevole variabilità in questa pigmentazione ( Figura 1A- F ), a causa sia dei genetici 17 , 23 che quelli ambientali 24 , 25 fattori. La cuticola di un tergite addominale è costituita da compartimenti di sviluppo anteriori e posteriori ( Figura 1G ), ciascuno dei quali può essere ulteriormente suddiviso a seconda della pigmentazione e dell&#39;ornamento 26 . Il vano anteriore comprende sei cuticolaI tipi (a1-a6) e lo scomparto posteriore comprendono tre (p1-p3) ( Figura 1G ). Di queste, la cuticola p1, p2 e a1 sono tipicamente piegate sotto il tergite in abdomeni non stretti in modo che siano nascosti. La cuticola affidabile è caratterizzata da una banda di pigmentazione pesante, qui indicata come una &quot;banda di pigmento&quot;, composta da tipi di cuticola a4 (pelosa con setole moderate) e a5 (pelose con grandi setole), con il bordo posteriore della banda Più pigmentato del bordo anteriore ( Figura 1G ). Anteriore a questa fascia è una regione di cuticola pelosa leggermente pigmentata, che ha setole posteriormente (a3) ​​ma non anteriormente (a2). La variazione della pigmentazione tra le mosche è osservata sia nell&#39;intensità della pigmentazione che nella larghezza della fascia di pigmento. In generale, la variazione è più grande nei segmenti più posteriori (segmenti addominali 5, 6 e 7) ed è più bassa nei segmenti più anteriori (addome addominale3 e 4) 24 . Inoltre, c&#39;è un dimorfismo sessuale nella pigmentazione di D. melanogaster , con i maschi in genere hanno completamente pigmentati quinto e sesto tergi addominali ( Figura 4C ). Nella maggior parte degli studi di pigmentazione addominale in D. melanogaster , la pigmentazione è stata trattata come un tratto categorico o ordinale, con il modello misurato 27 , 28 , 29 o semi-quantitativamente su scala 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . Questi metodi inevitabilmente soffrono di una mancanza di precisione, e poiché si basano sulla valutazione soggettiva della pigmentazione, è difficile confrontare i dati tra gli studi. Alcuni autori hanno quantificato le dimensioni spaziali della pigmentazione 38 , 39 , l&#39;intensità della pigmentazione di un particolare tipo di cuticola 23 , 25 , 39 , 40 , o l&#39;intensità media della pigmentazione nel tergite addominale nel suo complesso 41 , 42 , 43 . Tuttavia, questi metodi di quantificazione non misurano sia l&#39;intensità e la distribuzione spaziale della pigmentazione addominale contemporaneamente e pertanto non catturano le sfumature di come la pigmentazione varia inTergita propria. Inoltre, molti di questi metodi di quantificazione 38 , 41 , 42 , 43 richiedono la dissezione e il montaggio della cuticola addominale. Ciò richiede tempo e distrugge il campione, rendendolo non disponibile per ulteriori analisi morfologiche. Poiché la comprensione dello sviluppo e dell&#39;evoluzione della pigmentazione addominale si approfondisce, saranno necessari strumenti più sofisticati per misurare rapidamente e con precisione sia la distribuzione spaziale che l&#39;intensità della pigmentazione. L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di utilizzare l&#39;analisi delle immagini digitali per ottenere una misura replicabile e più precisa della pigmentazione addominale in D. melanogaster . La metodologia comprende tre fasi. In primo luogo, la mosca adulta è montata in modo non distruttivo e viene presa un&#39;immagine digitale dell&#39;addome dorsale. In secondo luogo, utilizzando una macro ImageJ, l&#39;utenteDefinisce una striscia anteriore-posteriore di pixel che si estende dall&#39;anteriore della cuticola a2 alla parte posteriore della cuticola a5 (casella verde, figura 1G ) sia sul terzo che sul quarto segmento addominale. Il valore medio di pixel lungo la larghezza di questa striscia viene quindi estratto lungo il suo asse lungo, generando un profilo che cattura la distribuzione spaziale e l&#39;intensità della pigmentazione in quanto cambia dall&#39;anteriore alla posteriore del tergito. In terzo luogo, uno script R viene utilizzato per descrivere il profilo di pigmentazione matematicamente utilizzando una spline cubica. Lo script R poi utilizza la spline e il suo primo e secondo derivato per estrarre la larghezza della cuticola a2-a5, la larghezza della fascia di pigmento e i livelli massimi e minimi di pigmentazione. Il metodo quantifica quindi sia le caratteristiche spaziali che la profondità della pigmentazione addominale. Questa metodologia quantifica la pigmentazione del terzo e del quarto tergi addominale,Che sono stati al centro di numerosi studi precedenti 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 , esclusivamente o in combinazione con più tergiti posteriori. Sebbene meno variabile rispetto al quinto e al sesto tergi addominale, i terzi e terzi non sono completamente pigmentati nei maschi, quindi questo protocollo può essere applicato sia ai maschi che alle femmine. Tuttavia, come indicato qui, il protocollo può essere utilizzato per misurare la pigmentazione nel quinto e sesto tergi addominale nelle femmine. Inoltre, piccole modifiche degli script utilizzati per estrarre le caratteristiche del profilo di pigmentazione dovrebbero permettere che il metodo venga utilizzato per quantificare la variazione della pigmentazione in un&#39;ampia varietà di altreorganismi.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 Biology Forceps</td><td>FST</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5040</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Scope</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>Base</td><td>Leica</td><td>MDG41</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Leica</td><td>DFC280</td><td></td></tr><tr><td>Gooseneck Cold Light Source</td><td>Schott</td><td>ACE 1</td><td></td></tr><tr><td>Image Acquisition Control Software</td><td>Micro-Manager v1.3.20</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr><tr><td>Image Analysis Software</td><td>ImageJ</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>Data Analysis Software</td><td>R 3.3.2</td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr><tr><td>LED</td><td>Thor Labs</td><td>LEDWE-15</td><td></td></tr><tr><td>Multimeter</td><td>Fluke</td><td>Fluke 75 Series II</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Petri dish</td><td>Celltreat Scientific Products</td><td>229663</td><td></td></tr><tr><td>Stage micrometer</td><td>Klarman Rulings, Inc.</td><td>KR-867</td><td></td></tr></tbody></table>

quantifying abdominal pigmentation in drosophila melanogaster

La pigmentazione è un tratto morfologicamente semplice ma altamente variabile che spesso ha un significato adattativo. Ha servito ampiamente come modello per comprendere lo sviluppo e l&#39;evoluzione dei fenotipi morfologici. La pigmentazione addominale in Drosophila melanogaster è stata particolarmente utile, consentendo ai ricercatori di identificare i loci che sono alla base delle variazioni inter- e intraspecifiche della morfologia. Fino ad oggi, tuttavia, la pigmentazione addominale D. melanogaster è stata ampiamente analizzata qualitativamente, attraverso un punteggio piuttosto che quantitativo, che limita le forme di analisi statistica che possono essere applicate ai dati di pigmentazione. Questo lavoro descrive una nuova metodologia che consente la quantificazione di vari aspetti del pattern di pigmentazione addominale di D. melanogaster adulte . Il protocollo include il montaggio del campione, la cattura delle immagini, l&#39;estrazione dei dati e l&#39;analisi. Tutto il software utilizzato per le macro delle funzioni di acquisizione e analisi delle immaginiScritta per l&#39;analisi delle immagini open source. Il vantaggio di questo approccio è la capacità di misurare con precisione i tratti di pigmentazione utilizzando una metodologia altamente riproducibile in diversi sistemi di imaging. Mentre la tecnica è stata utilizzata per misurare la variazione nei modelli di pigmentazione della terna di D. melanogaster adulte , la metodologia è flessibile e si applica generalmente ai modelli di pigmentazione in innumerevoli organismi diversi.

Il protocollo è stato utilizzato per esplorare l&#39;effetto dell&#39;allevamento della temperatura sulla pigmentazione addominale. Studi precedenti hanno dimostrato che un aumento della temperatura di sviluppo produce una diminuzione della diffusione della pigmentazione addominale in diverse specie di Drosophila , tra cui D. melanogaster 30 , 32 . In particolare, nei tergiti addominali 3 e 4, la portata della ...

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Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Questo lavoro presenta un metodo per quantificare rapidamente e con precisione la pigmentazione addominale di Drosophila melanogaster utilizzando l&#39;analisi di immagine digitale. Questo metodo semplifica le procedure tra l&#39;acquisizione di fenotipi e l&#39;analisi dei dati e include il montaggio del campione, l&#39;acquisizione di immagini, l&#39;estrazione del valore dei pixel e la misurazione del tratto.

Quantificazione della pigmentazione addominale in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

quantifying-abdominal-pigmentation-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Genetics

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

8.9K Views.  Lake Forest College.  Questo lavoro presenta un metodo per quantificare rapidamente e con precisione la pigmentazione addominale di Drosophila melanogaster utilizzando l'analisi di immagine digitale. Questo metodo semplifica le procedure tra l'acquisizione di fenotipi e l'analisi dei dati e include il montaggio del campione, l'acquisizione di immagini, l'estrazione del valore dei pixel e la misurazione del tratto. 

Video: Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a cost-effective in vivo method to identify heterochromatin-promoting compounds by using Drosophila. The Drosophila&#39;s DX1 strain, having a variegated eye color phenotype that reflects the extents of heterochromatin formation, thereby providing a tool for a heterochromatin-promoting drug screen. In this screening method, eye variegation is quantified based on the surface area of red pigmentation occupying parts of the eye and is scored on a scale from 1 to 5. The screening method is straightforward and sensitive and allows for testing compounds in vivo. Drug screening using this method provides a fast and inexpensive way for identifying heterochromatin-promoting drugs that could have beneficial effects in cancer therapeutics. Identifying compounds that promote the formation of heterochromatin could also lead to the discovery of epigenetic mechanisms of cancer development.

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is a widely used experimental model suitable for screening drugs with potential applications for cancer therapy. Here, we describe the use of Drosophila variegated eye color phenotypes as a method for screening small-molecule compounds that promote heterochromatin formation.

Un metodo di screening per l'identificazione di farmaci che promuovono l'eterocromatina utilizzando la drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

Ricerca

Genetica

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy and cheap methods to distinguish between individuals in a trial. A standard technique for this is CO2 anaesthesia and then labelling or wing clipping each fly. However, this is invasive and has been shown to affect behavior. Other techniques have used coloration to identify flies. This article presents a simple and non-invasive method for labelling Drosophila that allows them to be individually identified within experiments, using food coloring. This method is used in trials where two males compete to mate with a female. Dyeing allowed quick and easy identification. There was, however, some difference in the strength of the coloration across the three species tested. Data is presented showing the dye has a lower impact on mating behavior than CO2 in Drosophila melanogaster. The impact of CO2 anaesthesia is shown to depend on the species of Drosophila, with D. pseudoobscura and D. subobscura showing no impact, whereas D. melanogaster males had reduced mating success. The dye method presented is applicable to a wide range of experimental designs.

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

Tintoria Insetti per comportamentali saggi: il comportamento di accoppiamento di anestetizzati<em&gt; Drosophila</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

Neuroscienze

<meta charset="utf8"></head><body>Quantificazione imparziale degli ommatidi nei modelli oculari di Drosophila

Quantifying Drosophila melanogaster Eye Phenotypes: A Computational Approach Integrating ilastik and Flynotyper

The Drosophila melanogaster compound eye is a well-structured and comprehensive array of around 800 ommatidia, exhibiting a symmetrical and hexagonal pattern. This regularity and ease of observation make the Drosophila eye system a powerful tool to model various human neurodegenerative diseases. However, ways of quantifying abnormal phenotypes, such as manual ranking of eye severity scores, have limitations, especially when ranking weak alterations in eye morphology. To overcome these limitations, computational approaches have been developed such as Flynotyper. The use of a ring light allows for better qualitative images accessing the intactness of individual ommatidia. However, these images cannot be analyzed by Flynotyper directly due to shadows on ommatidia introduced by the ring light. Here, we describe an unbiased way to quantify rough eye phenotypes observed in Drosophila disease models by combining two software, ilastik and Flynotyper. By preprocessing the images with ilastik, successful quantification of the rough eye phenotype can be achieved with Flynotyper.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Quantificazione dei fenotipi dell'occhio ruvido nei modelli di Drosophila di sclerosi laterale amiotrofica con demenza frontotempora

The Drosophila eye system is a useful tool for studying various biological processes, particularly human neurodegenerative diseases. However, manual quantification of rough eye phenotypes can be biased and unreliable. Here we describe a method by which ilastik and Flynotyper are used to quantify eye phenotype in an unbiased way.

Quantificazione dei fenotipi oculari di Drosophila melanogaster : un approccio computazionale che integra ilastik e Flynotyper

The Drosophila melanogaster compound eye is a well-structured and comprehensive array of around 800 ommatidia, exhibiting a symmetrical and hexagonal ...

Biologia dello sviluppo

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

Drosophila pupa Addome Immunoistochimica

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Biologia

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Confronto quantitativo di Cis-Regulatory Element (CRE) Attività in transgenici Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is initiated by photon absorption-inducing isomerization of the chromophore, promoting conformational changes of the opsin and resulting in a second dark-stable photopigment state (metarhodopsin, M). Investigation of this bi-stable photopigment using random mutagenesis requires simple and robust methods for screening mutant flies. Therefore, several methods for measuring reductions in functional photopigment levels have been designed. One such method exploits the charge displacements within the photopigment following photon absorption and the huge amounts of photopigment molecules expressed in the photoreceptors. This electrical signal, named the early receptor potential (or early receptor current), is measured by a variety of electrophysiological methods (e.g., electroretinogram and whole-cell recordings) and is linearly proportional to functional photopigment levels. The advantages of this method are the high signal-to-noise ratio, direct linear measurement of photopigment levels, and independence of phototransduction mechanisms downstream to rhodopsin or metarhodopsin activation. An additional electrophysiological method called prolonged depolarizing afterpotential (PDA) exploits the bi-stability of Drosophila photopigment and the absorption-spectral differences of fly R and M pigment states. The PDA is induced by intense blue light, converting saturating amounts of rhodopsin to metarhodopsin, resulting in the failure of light-response termination for an extended time in darkness, but it can be terminated by metarhodopsin to rhodopsin conversion using intense orange light. Since the PDA is a robust signal that requires massive photopigment conversion, even small defects in the biogenesis of the photopigment lead to readily detected abnormal PDA. Indeed, defective PDA mutants led to the identification of novel signaling proteins important for phototransduction.

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

We present a protocol to electrophysiologically characterize bi-stable photopigments: (i) exploiting the charge displacements within the photopigment molecules following photon-absorption and their huge amount in the photoreceptors, and (ii) exploiting the absorption-spectra differences of rhodopsin and metarhodopsin photopigment states. These protocols are useful to screen for mutations affecting bi-stable photopigment systems.&#160;

Metodi elettrofisiologici per misurare i livelli di fotopigmento nei fotorecettori di Drosophila

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH (pHi) is influenced by many ion transporters and thus monitoring pHi is a useful tool for assessing transporter activity. Modern Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs) provide optical quantification of pHi in intact cells on a cellular and subcellular scale. This protocol describes real-time quantification of cellular pHi regulation in Malpighian Tubules (MTs) of Drosophila melanogaster through ex vivo live-imaging of pHerry, a pseudo-ratiometric GEpHI with a pKa well-suited to track pH changes in the cytosol. Extracted adult fly MTs are composed of morphologically and functionally distinct sections of single-cell layer epithelia, and can serve as an accessible and genetically tractable model for investigation of epithelial transport. GEpHIs offer several advantages over conventional pH-sensitive fluorescent dyes and ion-selective electrodes. GEpHIs can label distinct cell populations provided appropriate promoter elements are available. This labeling is particularly useful in ex vivo, in vivo, and in situ preparations, which are inherently heterogeneous. GEpHIs also permit quantification of pHi in intact tissues over time without need for repeated dye treatment or tissue externalization. The primary drawback of current GEpHIs is the tendency to aggregate in cytosolic inclusions in response to tissue damage and construct over-expression. These shortcomings, their solutions, and the inherent advantages of GEpHIs are demonstrated in this protocol through assessment of basolateral proton (H+) transport in functionally distinct principal and stellate cells of extracted fly MTs. The techniques and analysis described are readily adaptable to a wide variety of vertebrate and invertebrate preparations, and the sophistication of the assay can be scaled from teaching labs to intricate determination of ion flux via specific transporters.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Cellular ion transport can often be assessed by monitoring intracellular pH (pHi). Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs)&#160;provide optical quantification of intracellular pH in intact cells. This protocol details the quantification of intracellular pH through cellular ex vivo live-imaging of Malpighian tubules of Drosophila melanogaster with pHerry, a pseudo-ratiometric genetically encoded pH-indicator.

Ottica pH quantificazione di intracellulare in Drosophila melanogaster anatomista Epithelia con pH indicatore fluorescente geneticamente codificato

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary changes. In particular, the adult stage is a rich source of morphological traits for interspecific comparison, including wing pigmentation comparison. To study developmental differences among species, detailed observation and appropriate staging are required for precise comparison. Here we describe protocols for staging of pupal periods and quantification of wing pigmentation in a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera. First, we describe the method for detailed morphological observation and definition of pupal stages based on morphologies. This method includes a technique for removing the puparium, which is the outer chitinous case of the pupa, to enable detailed observation of pupal morphologies. Second, we describe the method for measuring the duration of defined pupal stages. Finally, we describe the method for quantification of wing pigmentation based on image analysis using digital images and ImageJ software. With these methods, we can establish a solid basis for comparing developmental processes of adult traits during pupal stages.

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

Protocols for staging pupal periods and measurement of wing pigmentation of Drosophila guttifera are described. Staging and quantification of pigmentation provide a solid basis for studying developmental mechanisms of adult traits and enable interspecific comparison of trait development.

Metodi per la gestione temporanea Pupal periodi e misura di ala pigmentazione della Drosophila guttifera

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary ...

Quantificazione della pigmentazione addominale in

Riepilogo

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