Questa tecnica può rispondere a importanti domande funzionali sulle risposte neuronali al gusto nei gangli genicolati, una parte cruciale del percorso del gusto interno della chorda tympani. Questa tecnica può essere utilizzata per monitorare le reazioni in tempo reale di più singoli neuroni in un singolo studio sperimentale, poiché le cellule registrate per animale sono significativamente più alte di quelle tipicamente osservate tramite il metodo elettrofisiologico. Con il mouse montato sul palo della testa in posizione supina su una piastra riscaldante, fai un'incisione della linea mediana di due centimetri nella pelle sopra la gola, dallo sterno al mento.
E ritrarre la pelle e le ghiandole sub-mascellari per esporre completamente i muscoli digastrici. Dopo aver individuato la cucitura nella muscolatura paratracheale, separare la cucitura con dissezione smussata e ritrarre il tessuto per aprirlo. Tagliare con cura un'apertura nella parte superiore della trachea abbastanza grande da adattarsi a un pezzo di tubo di polietilene senza tagliare più di metà del diametro della trachea e inserire il tubo nella trachea verso i polmoni.
Riposizionare i riavvolgitori per rilasciare la muscolatura paratracheale e ritrarre le ghiandole sub mascellari. Quindi, utilizzare una piccola quantità di colla veterinaria per sigillare la muscolatura paratracheale insieme sopra il tubo. Per rompere la bolla timpanica, stuzzicare delicatamente il muscolo digastrico desiderato verso l'alto e separare il tessuto connettivo.
Fare un'incisione all'estremità anteriore del muscolo, evitando i vasi sanguigni. E tirati indietro posteriormente fino a quando non sei libero dalla bolla timpanica. Inclinare leggermente la testa all'indietro per sollevare la bolla timpanica e individuare il ramo dell'arteria carotide anteriore al punto di inserzione posteriore del muscolo digastrico.
Palpare appena posteriore a questo vaso sanguigno per la struttura convessa della bolla timpanica e individuare una cucitura nella muscolatura. Usando due serie di pinzetti fini, smussare la cucitura fino a quando l'osso della bolla timpanica è visibile e utilizzare i riavvolgitori per mantenere una visione chiara dell'osso. Individuare la cucitura che corre anteriore a posteriore sulla bolla e utilizzare una sonda chirurgica per praticare un foro nell'osso al centro della cucitura, quindi, utilizzare una serie di forbici terminali fini per tagliare un'area circolare nell'osso, facendo attenzione a non tagliare i vasi sanguigni anteriori e posteriori o sotto la bulla.
Per esporre il genicolato, individuare la coclea. Anteriore alla coclea è il muscolo timpanico tensore. Usa le forbici a molla per tagliare e rimuovere questo muscolo.
Utilizzare la sonda chirurgica per praticare un foro nel promontorio cocleare e utilizzare immediatamente l'aspirazione per aspirare qualsiasi liquido che fuoriesci dal foro. Allargare il foro nella coclea, facendo attenzione a non danneggiare il vaso sanguigno che circonda la coclea, fino al bordo posteriore e laterale. E inclina la testa del mouse in avanti per individuare il foro nell'osso temporale sotto la precedente struttura cocleare.
Prendi nota della cresta anteriore al foro che si trova direttamente sopra il settimo nervo. E inserire una sonda chirurgica nel foro per consentire all'osso temporale di essere sollevato con cura per esporre il settimo nervo. Se il genicolato non è completamente visibile, inclinare delicatamente la testa dell'animale all'indietro e tentare di tirare su l'osso anteriore al nervo.
Se i gangli sono ancora oscurati, tirare su più osso da sotto, facendo attenzione a non posizionare la sonda in profondità sotto l'osso, in quanto ciò potrebbe danneggiare il genicolato. Per far funzionare il pannello tastant, utilizzare aspirato per rimuovere il liquido da sopra il genicolato e posizionare il mouse su un tampone assorbente sotto un microscopio di dissezione. Usa il foro lasciato nella bulla, il buco nell'osso temporale e il settimo nervo per localizzare il ganglio genicolato.
E usa il filtro FITCGFP sull'ambito epifluorescente per verificare la disponibilità di singoli GCaMP che esprimono neuroni gangliari genicolati. Posizionare saldamente l'ago di erogazione per una linea tastant nella bocca dell'animale e posizionare una capsula di Petri sotto la bocca per catturare qualsiasi liquido. Sincronizza l'inizio della registrazione video con l'inizio della presentazione tastant, guardando il feed live per risposte, deriva e infiltrazioni durante la registrazione.
Se si verificano infiltrazioni, aspirare il liquido fino a quando la vista del genicolato è chiara e riconsegnare il tastant. Se si verifica una deriva, controllare che tutte le parti del palo della testa siano saldamente serrate. Se non si verifica alcuna risposta, verificare che il liquido scorra e che il microscopio e la fotocamera siano focalizzati sulla posizione corretta senza che nulla oscuri il campo visivo.
Quando tutti gli esperimenti desiderati sono completati, allentare delicatamente i divaricatori e ripetere l'esposizione e l'analisi tastant sul lato opposto dell'animale. Come osservato, gli stimoli gustamenti applicati alla lingua dovrebbero provocare un rapido aumento transitorio della fluorescenza GCaMP, causando un notevole cambiamento di luminosità tra i neuroni che rispondono. L'analisi delle riprese video a fluorescenza consente la generazione di tracce corrispondenti ai cambiamenti di fluorescenza rispetto alla risposta di base all'interno delle singole regioni di interesse nel tempo.
I cambiamenti nell'intensità di fluorescenza al di sopra del livello di soglia sono considerati una risposta positiva. Oltre a danneggiare i gangli, è importante evitare il sanguinamento. Se si verifica sanguinamento, attendere che il sangue si coaguli prima di applicare soluzione salina e aspirazione per rimuovere il sangue dal campo visivo.
La visualizzazione dei gangli genicolati ha permesso ai ricercatori di misurare direttamente le risposte dei neuroni a stimoli simili al gusto e di identificare questi neuroni con strumenti come Cre-dependent GCaMP.
