Il numero di neuroni monitorati utilizzando questo metodo consente la raccolta di dati di rete neuronale che sarebbero impossibili utilizzando metodi più vecchi o altri. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di monitorare quasi 2.000 neuroni sensoriali primari contemporaneamente, rispondendo direttamente agli stimoli applicati alla zampa posteriore. Questa procedura è particolarmente adatta allo studio di interventi terapeutici per l'allodinia periferica e l'ipersensibilità al dolore.
Questo metodo può essere adattato allo studio dei gangli trigeminali o genicolati o utilizzato con sensori geneticamente codificati per molecole di segnalazione di tensione o cellule, come l'AMP ciclico. Ci vuole pratica per eseguire questo intervento chirurgico. Puoi esercitarti su un massimo di sei gangli della radice dorsale su un singolo animale.
A dimostrare la procedura sarò io, con l'assistenza di John Shannonhouse e Mr.Ruben Gomez. Per iniziare, posizionare il mouse su un pad riscaldato per mantenere la temperatura corporea a 37 gradi Celsius. Individuare l'allargamento lombare sentendo l'osso pelvico del topo.
Quindi, radere il dorso del mouse sopra l'area di allargamento lombare. Usando le forbici, fai un'incisione rettangolare su tre lati sopra l'allargamento lombare e piega la pelle con una pinza. Utilizzare le forbici da dissezione a molla da 13 millimetri per fare incisioni da tre a quattro millimetri sul lato destro della colonna vertebrale.
Usa le forbici per tagliare la pelle e i muscoli ai lati per esporre la colonna vertebrale. Quindi, usando forbici da otto millimetri, tagliare via il muscolo e il tessuto connettivo per pulire il processo trasversale del lato destro L5 DRG. Cerca di ridurre al minimo il sanguinamento usando cotone o Gelfoam per assorbire il sangue.
Tagliare il processo trasversale L5 sul lato destro utilizzando rongeur di Friedman-Pearson o forti pinze sottili, facendo attenzione a non toccare il DRG. Quindi, sposta il mouse e il termoforo sul palco personalizzato. Utilizzare nastro adesivo per fissare l'animale e la piastra elettrica in posizione.
Posizionare il naso dell'animale nel cono del naso per l'anestesia continua con isoflurano. Fissare la zampa posteriore destra che sporge in una posizione fuori dal palco per una facile applicazione degli stimoli. Fissare la colonna vertebrale in posizione con i morsetti dello stadio sulla pelle sulle vertebre o l'osso pelvico appena rostrale e caudale al DRG L5.
Regolare i morsetti e il palco per rendere la superficie del DRG il più livellata possibile. Quindi, posizionare lo stadio sotto il microscopio in modo che l'obiettivo sia direttamente otto millimetri sopra il DRG quando viene abbassato. Inserire il termometro rettale.
Collegare le linee elettriche alla piastra riscaldante e al termometro rettale. Collegare il cono del naso alle tubazioni del gas isoflurano. Utilizzare un microscopio confocale verticale con un obiettivo 10x 0,4 DIC e il software associato per l'imaging.
Utilizzare le impostazioni del filtro FITC verde di eccitazione a 495 nanometri, emissione a 519 nanometri e lunghezza d'onda di rilevamento tra 500 e 580 nanometri. Sotto il microscopio, trova la superficie del DRG. Regolare i morsetti sullo stage in modo che la superficie DRG sia il più livellata possibile e la superficie massima venga visualizzata sul piano focale.
Monitorare l'animale durante tutta la procedura per mantenere l'anestesia isoflurana senza sovradosaggio. Per caricare il protocollo di scansione rapida del microscopio, utilizzare le impostazioni tipiche di dimensioni voxel 2,496 per 2,496 per 16 micron, 512 per 512 pixel, 10 fette ottiche Z-stack, un'unità Airy per 32 micrometri, 1% potenza laser di 488 nanometri e cinque milliwatt, tempo pixel 1,52 microsecondi, tempo di linea 0,91 millisecondi, tempo di fotogramma 465 millisecondi, velocità di scansione LSM di otto, scansione bidirezionale, guadagno rilevatore PMT 650 volt e guadagno digitale di uno. Fai una breve scansione di otto cicli del DRG facendo clic su Avvia esperimento nella scheda Acquisizione.
Crea un filmato eseguendo una proiezione ortogonale delle scansioni a una scansione per fotogramma nel tempo. Controlla manualmente la chiarezza dell'immagine e gli artefatti dell'immagine, come le onde di luminosità che attraversano il DRG. Regolare la posizione del morsetto e lo spessore della sezione ottica e ripetere questo passaggio fino a ottenere un filmato chiaro e di alta qualità.
Quindi, caricare il protocollo di scansione ad alta risoluzione del microscopio utilizzando le impostazioni tipiche di dimensioni voxel 1.248 per 1.248 per 14 micron, 1024 per 1024 pixel, sei fette ottiche Z-stack, 1.2 unità Airy o 39 micrometri, 5% potenza laser di 488 nanometri e 25 milliwatt, tempo pixel 2.06 microsecondi, tempo di linea 4.95 millisecondi, tempo di fotogramma 5.06 secondi, velocità di scansione LSM di sei, scansione bidirezionale, guadagno del rilevatore PMT a 650 volt e guadagno digitale di uno. Fare clic sul pulsante Avvia esperimento nella scheda Acquisizione per creare un'immagine ad alta risoluzione del DRG. Caricare il protocollo di scansione rapida del microscopio e registrare l'attività spontanea nel DRG per 80 cicli.
Generare un filmato di proiezione ortogonale e verificare che l'immagine sia di qualità sufficiente per l'analisi. Per applicare stimoli, impostare il microscopio per eseguire da 15 a 20 scansioni. Attendere il completamento delle scansioni da uno a cinque per produrre la linea di base.
Applicare lo stimolo durante le scansioni da sei a 10. Attendere almeno cinque minuti dopo ogni stimolo prima di applicare quello successivo per prevenire la desensibilizzazione. Per una pressa meccanica, tenere il pincher dell'algometro con la zampa tra le pale senza toccare la zampa.
Pizzicare la zampa iniziando immediatamente dopo la fine della scansione cinque e fermandosi immediatamente dopo la scansione 10. Monitorare la forza di pressatura con un algometro e assicurarsi che non superi i 10 g oltre la forza desiderata. Per gli stimoli termici, riscaldare un becher d'acqua appena sopra la temperatura desiderata.
Quando l'acqua è alla temperatura corretta, applicare lo stimolo immediatamente dopo la scansione cinque immergendo la zampa nell'acqua. Tirare via il becher immediatamente dopo la scansione 10. L'esposizione chirurgica a L5 DRG seguita da microscopia confocale ha permesso di visualizzare fino a 1.800 neuroni contemporaneamente utilizzando topi Pirt-GCaMP3.
I neuroni sensoriali primari sono stati osservati in un ensemble a livello di popolazione per transitori spontanei di calcio in assenza di stimoli e in risposta a stimoli nel loro normale contesto fisiologico. Forti stimoli o calore nocivo hanno aumentato le risposte del calcio. Rispetto alla pressatura con 100 g, la pressione con 300 g ha aumentato il numero di neuroni che producono transitori di calcio e l'area delta F di F0 sotto la curva.
Il calore caldo in un intervallo di temperatura non nocivo di 21 e 45 gradi Celsius ha aumentato il numero di neuroni che producono transitori di calcio e l'area delta F di F0 sotto la curva. Le temperature non nocive hanno attivato un numero minore di neuroni che producono transitori rispetto a uno stimolo termico nocivo a 57 gradi Celsius. Inoltre, i neuroni di diametro più piccolo e medio producevano calcio transitorio spontaneamente e sotto tutti gli stimoli, ma i neuroni di diametro maggiore producevano solo transitori di calcio in risposta allo stimolo pressante di 300 g.
Il DRG deve essere livellato e lo spessore ottimale della fetta ottica. Dovrebbe essere tale da poter rilevare il numero massimo di celle e non c'è ondulazione nel film. Questa tecnica è stata utilizzata per analizzare le modalità sensoriali a livello di popolazione per la somatosensazione e il gusto e per studiare i neuroni adiacenti che si attivano in coppia o in cluster sincronizzati che contribuiscono al dolore cronico e neuropatico.
