Questo protocollo consente di osservare le funzioni delle cellule del gusto in un microambiente naturale con connessioni neurali e circolazione sanguigna che rimangono intatte. Utilizzando questa tecnica, la comunicazione cellula-cellula può essere studiata in vivo. Per iniziare, riempire i serbatoi del sistema di perfusione a flusso pressurizzato con saliva artificiale e detastanti.
Collegare la linea dell'aria compressa all'ingresso del regolatore e impostare la pressione dell'aria nel sistema di erogazione fluidica su 30-50 libbre per pollice quadrato. Impostare la pressione di uscita del regolatore a 0,4 libbre per pollice quadrato e verificare se il liquido inizia a fuoriuscire dal tubo. Collegare il collettore dai serbatoi alla porta di ingresso della micro linguetta, quindi collegare la porta di uscita della micro lingua a una pompa a siringa e prelevare il liquido a circa 300 microlitri al minuto per stabilire una condizione di stato stazionario.
Confermare che il volume della goccia appesa sotto la micro linguetta rimanga costante e regolare la pressione dell'aria e la portata per ottenere l'altezza del campione desiderata. Una volta impostato il sistema microfluidico, scollegare la linea dell'aria compressa e spegnere la pompa della siringa fino a quando il mouse non è stato preparato per l'imaging in vivo. Dopo aver somministrato l'anestesia al topo, iniettare per via endovenosa TRITC-destrano attraverso una via retro-orbitale per osservare la circolazione sanguigna durante l'imaging.
Con il mouse posto in posizione supina, spruzzare il 70% di etanolo sulla sua testa. Usa una pinza per sollevare leggermente la pelle della testa, quindi usa le forbici per tagliare circa sette millimetri quadrati di pelle. Dopo aver pulito i capelli intorno al cuoio capelluto, rimuovere il periosteo da sotto la pelle e applicare un adesivo istantaneo sul cranio.
Quindi collegare il fissatore di teste personalizzato. Una volta che l'adesivo istantaneo è indurito, applicare la colla dentale attorno al fissatore della testa e solidificarlo mediante illuminazione con una luce blu. Utilizzando l'adesivo istantaneo per incollare il labbro inferiore del mouse all'unità inferiore della micro lingua, quindi posizionare il mouse sulla scheda di preparazione del mouse e fissare l'unità inferiore alla micro linguetta ai montanti di tenuta allineando i fori sul bordo della micro lingua con i montanti.
Stringere il fissatore della testa del mouse sul supporto del fissatore della testa sulla scheda e regolare la distanza tra la testa del mouse e il dispositivo. Quindi, utilizzando il supporto del fissatore della testa, ruotare la testa del mouse senza intoppi di circa 45 gradi. Dopo aver fissato il mouse alla scheda, utilizzare una pinzetta di plastica per disegnare delicatamente la lingua.
Quindi, utilizzando l'adesivo istantaneo, collegare il lato ventrale della lingua al lato superiore dell'unità inferiore della micro lingua. Per mantenere la lingua umida, pulire la superficie con un batuffolo di cotone bagnato, quindi posizionare un pezzo di tessuto imbevuto di saliva artificiale sulla superficie esposta della lingua. Posizionare le rondelle curve sui montanti, tenendo la parte inferiore della micro lingua, quindi spostare la preparazione del mouse allo stadio del microscopio.
Posizionare la linguetta esposta del mouse sotto il centro approssimativo dell'area dell'obiettivo del microscopio, assicurandosi di non deviare dalla gamma dinamica dello stadio, quindi stringere le viti per fissare saldamente la scheda del mouse sul palco. Posizionare una piastra riscaldante sotto il mouse per mantenere la temperatura corporea tra 36,5 e 37,5 gradi Celsius. Per evitare che il liquido penetri nella trachea del topo, posizionare un sottile pezzo di carta intrecciata all'interno della bocca del topo, quindi rimuovere il tessuto bagnato posto sulla superficie della lingua e posizionare la micro lingua preparata sulla lingua del topo, in modo tale che la superficie della lingua sia visibile attraverso la finestra di imaging.
Fissare la micro linguetta avvitando delicatamente entrambe le estremità con una pressione di compressione minima. Per iniziare ad acquisire immagini, aprire il software del microscopio, quindi accendere il laser a due fotone da 920 nanometri. Montare l'obiettivo di immersione in acqua sul microscopio, quindi abbassare l'obiettivo sulla finestra di imaging della microlingua e immergere l'obiettivo.
In modalità fotocamera, illuminare la superficie della lingua accendendo la luce blu di una lampada al mercurio. Per trovare il piano focale approssimativo, regolare l'asse Z e cercare un segnale di autofluorescenza dalle papille filiformi. Quindi, utilizzando la manopola di regolazione X e Y, individuare una papille gusta mobile.
Passare alla modalità multi-fotone, quindi impostare la lunghezza d'onda di eccitazione, il set di filtri di emissione, la modalità di scansione e le dimensioni del fotogramma per l'acquisizione delle immagini. Con la papille gustatica al centro della finestra di imaging, individuare i vasi sanguigni che circondano la papille gustatica a circa due terzi dell'altezza della papille gustatica e visualizzare la circolazione sanguigna. Se il flusso sanguigno è intasato, allentare leggermente le viti di fissaggio per riprendere il flusso sanguigno.
Regolare l'asse Z per trovare il piano Z di una papille gustativa contenente un numero adeguato di cellule gustative, quindi procedere con l'imaging del calcio da due a sei Hertz per 80 secondi. Dopo l'avvio dell'imaging, accendere il serbatoio del sistema fluidico per fornire una soluzione di gusto per 20 secondi. Dopo 20 secondi di stimolazione del gusto, riportare il serbatoio alla saliva artificiale.
Durante l'imaging, attendere circa tre o quattro minuti tra le sessioni fornendo costantemente saliva artificiale per mantenere la lingua umida e lavare via il tastant rimanente dalla sessione precedente. La superficie della lingua del topo Pirt-GCaMP6f-tdTomato è ricoperta da papille filiformi autofluorescenti e papille gustative scarsamente diffuse. Le papille filiformi in giallo vengono catturate utilizzando un fotorilevatore a 500-550 nanometri e possono essere osservate dalla superficie stessa della lingua fino a circa 25 micrometri di profondità.
I segnali GCaMP in verde rilevati dal filtro da 500 a 550 nanometri e i segnali tdTomato in rosso, rilevati dal filtro da 607 a 670 nanometri, rappresentano le cellule del gusto. Il segnale tdTomato è ottenuto per l'analisi metrica del rapporto. I vasi sanguigni che circondano la papille gustativa vengono acquisiti utilizzando il filtro da 500 a 550 nanometri impostato nel tessuto connettivo del collagene, che supporta strutturalmente la papille gustativa, viene acquisito utilizzando il set di filtri da 447 a 460 nanometri.
In questo esempio rappresentativo di screening del gusto in vivo utilizzando l'imaging del calcio, ogni cellula del gusto è delimitata da linee tratteggiate. In questo studio, la cellula 2 ha risposto sia ai tastants dolci che a quello umami. E la cellula 3 ha risposto sia ai tastants a basso che ad alto contenuto di sale.
Nessuna delle cellule di questa papille gusta l'ha risposto ai sapori aspri. Poiché lo scopo di questo esperimento è quello di osservare la funzione cellulare dei sapori nell'ambiente naturale, è importante consegnare le fluorescenti nei vasi sanguigni nella fase di preparazione e confermare la sua circolazione durante l'esperimento.
