Noi riconosciamo Silke Sachse e Beate Eisermann nello sviluppo di questa metodologia, Pablo Traversa per disegnare i progetti di blocco di montaggio e Daniela Pelz per l&#39;utilizzo dello schema in figura 1. Siamo grati a Silke Sachse, Pavan Ramdya e Raffaello Rytz per i commenti sul manoscritto. R. Bell è supportato da una Boehringer Ingelheim PhD Fellowship Foundation. La ricerca nel laboratorio di R. Benton è finanziato da un Consiglio europeo della ricerca a partire Independent Researcher Grant e il Fondo nazionale svizzero Science Foundation.

1. Blocco di Montaggio <ol><li> Il blocco plexiglass montaggio (Figura 1A) dovrebbero essere apportate alle specifiche esatte espresse nella matrice (disponibile dalla <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> ) Per consentire un facile montaggio e la dissezione di mosca. Filo attraverso le viti dal retro ma non li estendono oltre la parte anteriore del blocco; loro posizione sarà regolato durante la preparazione della animale (vedi 2,7). </li><li> Utilizzando un trapano precisione, intaccare il bordo superiore della camera circolare per la mosca, scavi sotto la superficie per fare spazio per il corpo della mosca, riducendo lo spessore del blocco a questo punto. </li><li> Tagliare una griglia di rame con un bisturi e perpendicolare in prossimità del fondo della fessura di creare un &quot;collo&quot;. Assicurarsi che i due lembi ottenuti sono di livello, in quanto ciò contribuirà l&#39;inserimento della mosca. </li><li> Con uno stuzzicadenti, mettere una piccola goccia di colla sul blocco di montaggio sopra la camera circolare per la mosca. Posizionare la griglia di rame sulla colla e posizione in modo che la fessura è centrata sul blocco (Figura 1A). Premere delicatamente e rimuovere ogni eccesso di colla. Con un paio di pinzette, aggiungere piccole gocce di colla alle alette su ciascun lato e piegare la griglia sul fronte del blocco in modo che la fessura è rivolta verso il basso diritte. Assicurarsi che la parte superiore della griglia è a livello con il blocco. Lasciare asciugare completamente. </li><li> Assemblare un titolare di filo: tagliare un coprioggetto di plastica a metà e togliere un pezzo centrale per fare una forma a &quot;U&quot;. Utilizzare cera d&#39;api di incollare un pezzo di filo nella parte superiore della &quot;U&quot;, non rendono il cavo troppo teso. </li><li> Costruire lo scudo antennale: fare un buco in un vetrino di plastica con una carta hole-punch. Tagliare i bordi del coprioggetto a 0,5 x 0,7 cm. Incollare il vetrino di plastica forato per nastro adesivo e poi mettere una goccia di etanolo sul nastro esposto attraverso il foro dirimuovere l&#39;adesivo. </li></ol> 2. Preparazione degli animali <ol><li> Le mosche del genotipo appropriata - cioè tenendo la combinazione desiderata di &quot;driver&quot; e l&#39;attività-reporter transgeni - dovrebbe essere 1-3 settimane di età, la cuticola dei giovani mosche è troppo morbido e difficile da tagliare. Quando gli esperimenti richiedere che il confronto diretto di genotipi diversi, e al fine di corrispondere i livelli di espressione del transgene, mosche dovrebbe essere pari età al fine di evitare differenze fisiologiche legate all&#39;età. Se il genere non è importante, preferiamo usare le mosche di sesso femminile poiché hanno più la testa e sono più facili da manipolare. </li><li> Anestetizzare le mosche da raffreddamento su ghiaccio. </li><li> Introdurre una mosca nel blocco di montaggio. Tenere la mosca dal giunto ala e farla scorrere, dorsale-prima superficie, lungo la fessura della griglia di rame in modo che sia sospesa dal suo collo (Figura 1B-C). Se necessario, si ruotare fino sta guardando. </li><li> Posizionare una spina bel cactus di fronte alla fly testa per impedirne la fuoriuscita (Figura 1B-C). Posizionare la colonna vertebrale cactus davanti proboscide per impedire che si sposti. Fissare la colonna vertebrale cactus al blocco utilizzando cera d&#39;api. Assicurarsi che la parte superiore della testa è a livello con la parte superiore del blocco. </li><li> Fissare la testa della mosca al blocco con una piccola goccia di resina (sciolto in etanolo). Posizionare il blocco in una scatola umidificata e consentire la colofonia indurire per circa un&#39;ora. </li><li> Utilizzando pinze, tirare la piastra antennale in avanti e far cadere il filo sul supporto (cera-side out, vedi 1.5) nella piega cuticolare tra l&#39;antenna e la testa. Fissare il supporto alla parte anteriore del blocco con cera d&#39;api. </li><li> Usando le viti costruito nel blocco, spingere delicatamente il titolare del filo in avanti per creare uno spazio tra la piastra antennale e la testa. </li><li> Posizionare lo scudo antennale (vedi 1.6) sopra la parte superiore della testa della mosca con il foro posizionato centralmente. Fissare con cera d&#39;api per la parte superiore del blocco di montaggio. </li><li> Utilizzando una lama-splitter, cuta piccolo buco nel nastro sullo scudo esponendo la cuticola della testa della mosca dietro l&#39;antenna. Il foro non dovrebbe estendersi oltre gli occhi per evitare che la preparazione di fuoriuscire. </li><li> Sigillare il foro tra il nastro e la cuticola con due componenti di silicio. Rimuovere l&#39;eventuale eccesso di silicone dalla parte superiore della testa della mosca. </li><li> Mettere una goccia di Drosophila Ringer salina (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 36 mM saccarosio, 5 mM di HEPES, pH 7,3) sulla testa. Assicurarsi che non vi siano perdite: le antenne dovrebbero rimanere completamente asciutto. Utilizzando una lama zaffiro, tagliato un buco nella cuticola. In primo luogo, leggermente punteggio lungo la piega cuticolare direttamente dietro l&#39;antenna, quindi tagliati lungo gli occhi e attraverso il ocelli sul retro. Infine, piegare il pezzo di cuticola oltre il limite segnato e tagliare dalla parte inferiore per evitare di recidere i nervi antennali. </li><li> Rimuovere con cautela ghiandole e trachea con le pinzette sottili. Sciacquare ripetutamente con Drosophila </em&gt; Ringer, lasciando una grossa goccia sulla testa. </li></ol> 3. Odore stimolo di consegna <ol><li> Siringhe odore: inserire un tampone di cellulosa in una siringa 2 ml di plastica con pinzette pulite e pipetta (usando punte filtro) 20 pl di odore, diluite come desiderato in un solvente appropriato, usando la punta della pipetta per spingere il pad in profondità nella canna . Plug e il tappo della siringa fino al momento. Diluizioni odore fresco deve essere preparato almeno ogni 3 mesi (o più frequentemente, per gli odori altamente volatili e / o di uso frequente), e pastiglie nuove devono essere preparati per siringhe odore appena prima di ogni sessione di registrazione. Non usare pagliette odori per più di tre stimoli, poiché la concentrazione di odore potrebbe decadere. </li><li> Su misura olfattometro (Figura 2): un flusso di aria primaria (1 l / min) è diretto attraverso la tubazione Teflon (0,4 mm di diametro interno); 27 centimetri a monte della uscita di questo tubo, un flusso d&#39;aria secondaria (1 l / min ) è aggiunto. Entrambi i flussi d&#39;aria generati da pompe a membrana, ela portata viene regolata da due misuratori di portata indipendenti. I flussi d&#39;aria può essere umidificata passando attraverso l&#39;acqua in bottiglie di lavaggio di gas, anche se occorre prestare attenzione per evitare un&#39;eccessiva umidificazione (vale a dire oltre il ~ 60%). Il flusso d&#39;aria secondaria è diretta attraverso una siringa odore o una siringa vuota: siringhe sono connessi al flusso d&#39;aria attraverso un ago di siringa (1,2 mm di diametro esterno) perforare lo stantuffo. Una valvola a tre vie magnetico controllato attraverso una unità di controllo della valvola (ad es VC6 Harvard Apparatus) è usato per passare l&#39;aria pulita e stimolo odore. </li></ol> 4. Imaging in vivo <ol><li> Descriviamo qui di immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza in posizione verticale (vale a dire diritto fisso fase Zeiss Axio D1 Examiner) dotata di un obiettivo 20x acqua (per es Zeiss W &quot;Plan-Apochromat&quot; 20x / 1,0 M27 DIC) (Figura 2). Per l&#39;imaging con G-CAMP (eccitazione / emissione: 488/509 nm), utilizzare un blocco filtro con le seguenti proprietà: filtro di eccitazione 450-490 nm, Specchio dicroico (T495LP) e 500-550 nm filtro per le emissioni (Chroma ET). Posizionare il blocco di montaggio contenente la mosca al microscopio. Posizionare l&#39;uscita dei circa 0,5 cm olfattometro di fronte antenne della mosca. </li><li> Abbassare l&#39;obiettivo fino a toccare la soluzione di Ringer sulla testa della mosca. Guardando attraverso il visualizzatore luminoso sotto-campo di illuminazione, la posizione preparazione modo che il foro nella capsula testa è centrato e suoi confini sono a fuoco. Passare a luce fluorescente e regolare la messa a fuoco fino a quando puoi vedere i neuroni marcati (risulta dal basale fluorescenza verde del G-cAMP). </li><li> Fine Focus sul glomeruli di interesse con l&#39;acquisizione di immagini con un Charge-Coupled Device (CCD) telecamera (ad esempio CoolSNAP-HQ2 sistema di fotocamera digitale) montata sul microscopio usando software appropriato ripresa (ad es Metafluor) (Figura 3A). Chiudere il diaframma nel percorso della luce di illuminazione per limitare la luce di eccitazione alla zona immaginata. </li><li> Per la schedatura dei cattivi odori evocatiattività, impostare la velocità di acquisizione a 4 Hz e regolare il tempo di esposizione per ottenere valori di fluorescenza entro il campo dinamico di fotocamera CCD, ma non inferiore a 1000 (unità arbitrarie), con almeno 12-bit risoluzione dinamica. Il tempo di esposizione non deve superare i 100 ms, se possibile, di ridurre G-CAMP photobleaching. Se la risoluzione spaziale della fotocamera lo consente, è possibile aumentare il binning (numero di pozzi sul chip che verrà categorizzata in un pixel digitale) per ridurre il tempo di esposizione. Otteniamo le immagini di 350x225 pixel (con un binning di 2x2), corrispondenti a 210x135 micron presso la preparazione. Queste impostazioni sono ottimali per catturare odori glomerulari indotte risposte di G-CAMP con una buona risoluzione spaziale e temporale, limitando giornalista sbiancamento. </li><li> Impostare i parametri di misura. Abbiamo tipicamente registrare per 10 secondi (cioè 40 fotogrammi), con stimolazione odore generalmente a partire 4 secondi dopo l&#39;inizio del periodo di acquisizione (telaio 15) e una durata di un secondo (uino fotogramma 19). Una preparazione mosca può normalmente essere testati con un massimo di 25-30 stimoli odore diverso, spesso limitate da un declino irreversibile nel segnale fluorescente del reporter a causa di photobleaching. Il inter-stimolo intervallo dipenderà dalla forza della risposta osservata e il tasso di photobleaching. La lunghezza appropriata di intervallo inter-stimolo per evitare di adattamento sensoriale può essere determinata in modo approssimativo con la presentazione ripetuta di un odore controllo positivo (se conosciuto) in esperimenti di prova. L&#39;inclusione di questo odore ogni ~ 10 stimoli di una stessa serie può consentire la verifica della continua vitalità e la reattività costante della preparazione. </li></ol> 5. Elaborazione dati e analisi I dati vengono trattati con ImageJ (con Mac biofotonica plug-in, <a href="http://www.macbiophotonics.ca/">www.macbiophotonics.ca</a> ) e personalizzati programmi scritti in Matlab e R come segue: <ol><li> Correggere per artefatti da movimento di esempio:allineare tutte le immagini corrispondenti ad una preparazione di animale (per esempio 30 misure di 40 fotogrammi ciascuna) con il &quot;corpo rigido&quot; modo di StackReg / TurboReg ( <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg">bigwww.epfl.ch / Thévenaz / stackreg</a> ) in ImageJ. Questo passaggio è necessario per rimuovere spostamenti nella posizione dei neuroni marcati rispetto al telaio acquisizione entro e tra le misurazioni. Tuttavia, è solo possibile rimuovere spostamenti nel piano xy. I dati devono essere eliminata se i cambiamenti si verificano forti a fuoco. </li><li> Segmento stack in singole misurazioni di 10 secondi (40 frame). </li><li> Corretto per lo sbiancamento artefatti: l&#39;esposizione alla luce fluorescente causerà fluorescenza a decadere nel corso di una singola misura 10. In alcuni casi, è importante per correggere questo decadimento prima di analizzare i dati. Per ciascuna misurazione calcolare un frame sfondo. Questo dovrebbe essere la media di diversi fotogrammi prima della comparsa dello stimolo (ad esempio frames 6-14). Dividere ogni fotogramma di questo backgintorno telaio per ottenere le modifiche relative fluorescenza. Calcolare il valore medio relativo fluorescenza per ogni fotogramma facendo la media di tutti i pixel all&#39;interno dell&#39;area marcato da G-CAMP. Montare un doppio esponenziale alla curva di fluorescenza media, attribuendo maggiore importanza ai telai prima stimolo e peso zero al tempo della risposta odore (20 fotogrammi dall&#39;insorgenza stimolo nel nostro caso). Sottrarre la curva montato dalla curva relativa fluorescenza di ciascun pixel. Moltiplicare i frame corretti dalla cornice di fondo di ri-ottenere i dati grezzi. Questo tipo di correzione può portare ad una modifica la dinamica di risposta se il segnale non ritorna alla linea di base alla fine della misura (ad esempio se risposte eccitatorie inibitori o molto forti vengono evocati) (Figura 4). Mentre correzione di artefatti sbianca è utile in molti casi, l&#39;interpretazione dei parametri temporali deve essere fatto con cautela se una correzione candeggiante è applicato. </li><li> Calcolare la variazione relativa di fluorescenza (&amp; DeLTA; F / F) per ciascun frame di ogni misurazione come (F i-F 0) / * 0 F 100, F dove 0 è il fotogramma di sfondo (vedi 5.3), e F i il valore di fluorescenza per l&#39;i-esimo fotogramma di la misurazione. </li><li> Calcolare la media Af / F all&#39;interno di una regione circolare di interesse in un glomerulo (Figura 3B) con un diametro di 10 pixel per ottenere tracce di attività (Figura 5A). Se lo si desidera, trasformare queste tracce in mappe di calore che utilizzano ImageJ (Figura 5A). </li><li> Calcolare l&#39;ampiezza di picco della risposta sottraendo la media Af / F di quattro fotogrammi prima stimolazione dalla media Af / F di quattro frame durante il picco della risposta. La stessa procedura viene utilizzata sia per illustrare modelli di risposta spaziali (si veda la Figura 3B) e di quantificare l&#39;ampiezza della risposta in specifiche regioni di interesse in tutta mosche (vedi Figura 5B). La risposta di picco può essere quantificato integrando l&#39;area sotto la curva durante il tempo dello stimolo, o averaging le cornici intorno al massimo della risposta. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Abbiamo usato i protocolli di cui sopra per registrare ed analizzare le risposte di acido propionico evocate di mosche che esprimono CaMP1.6 G-28 sotto il controllo del promotore per il co-recettore olfattivo IR8a, che è attiva in molti differenti popolazioni di OSN (29,30 Figure 3-5). La stimolazione con 1% di acido propionico provoca aumenti G-CAMP fluorescenza - indica aumenti del calcio intracellulare - in OSN innervano due glomeruli, DC4 e DP1l (Figura 3B). Si illustrano diversi modi di rappresentare dati provenienti da più mosche in figura 5: tracce di attività di linea, mappe di calore e una trama di risposte bar di picco. Risposte propionico-evocati hanno ampiezze dei picchi distinti e le dinamiche temporali e DC4 DP1l. Inoltre, anche se le risposte sono generalmente robusti, la variabilità tra i singoli animali possono essere osservati anche in entrambi i glomeruli (vedere cheatmaps in figura 5A). La quantificazione delle risposte di picco (Figura 5B) consente un semplice confronto statistico tra glomeruli diversi e odori diversi tra animali. Tuttavia, i cattivi odori evocati risposte di calcio può avere dinamica temporale non uniformi, e quantificare la loro grandezza con un singolo valore non tiene conto di questa complessità. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig1.jpg" /> Figura 1. Schematica del blocco di montaggio (A) prima e (B) dopo l&#39;introduzione della mosca, e (C) una vista dall&#39;alto in primo piano (adattato da 31). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig2.jpg" /> Figura 2. Schematica del set-up sperimentale. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig3.jpg" /> Figura 3. (A) Vista dall&#39;alto della preparazione dopo la fase fly 2.8 (riquadro a sinistra) e cruda immagine di fluorescenza delle antelobi NNAL etichettati con G-CaMP1.6 (genotipo: promoter IR8a: GAL4; UAS: G-CaMP1.6). DC4 e DP1l glomeruli si distinguono per la loro morfologia, dimensioni e la posizione e sono contrassegnati in rosso e blu, rispettivamente. (B) con codice a colori immagine della risposta di acido propionico (1% v / v). L&#39;immagine corrisponde al Af / F del picco della risposta calcolato come indicato nella fase 5,6 (vedi anche figura 5A). Il ColorScale a sinistra indica il Af / F% del valore. I cerchi neri indicano la posizione e la dimensione della regione di interesse utilizzato per quantificare le risposte (vedi figura 5). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig4.jpg" /> Figura 4. Correzione sbianca del segnale reporter fluorescente. Esempi di effetti di correzione candeggina, come descritto nel passaggio 5,3. Dati campione sul pannello di sinistra può essere corretta senza grandi cambiamenti nella forma della risposta. I dati si riferiscono sul pannello di destra è gravemente incidereed dalla correzione candeggina, probabilmente perché il segnale cade e viene mantenuta al di sotto baseline dopo la cessazione odore stimolo. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig5.jpg" /> Figura 5 (A) Top:. Dinamica temporale di risposte di calcio di glomeruli DC4 (sinistra) e DP1l (destra) di acido propionico (1% v / v). Le tracce nere indicano la mediana della media Af / F all&#39;interno della regione di interesse (vedi Figura 3B) in otto animali. La superficie grigia indica l&#39;intervallo tra il primo e terzo quartile della distribuzione. Presentazione dei valori mediani e di quartile fornisce ulteriori informazioni sulla variabilità e la distribuzione delle risposte osservate di errore medio e standard. Le caselle verdi e magenta indicano i fotogrammi media per calcolare le risposte di picco mostrato in figura 3b, e quantificati nella Figura 5B. In basso: le mappe di calore mostrano i dati di risposta per tutti i singoli animali in file separati, con Af / F valori represented dal ColorScale (estrema destra). Le barre orizzontali neri indicano il tempo e la durata dello stimolo. (B) mediani risposte punta ad acido propionico in otto animali per DC4 e DP1l glomeruli. Le barre di errore indicano l&#39;intervallo tra primo e terzo quartile della distribuzione.

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B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain.">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112, 271-282 (2003).</li><li>Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+expressed+cameleon+in+Drosophila+melanogaster+is+used+to+visualize+olfactory+information+in+projection+neurons.">Genetically expressed cameleon in Drosophila melanogaster is used to visualize olfactory information in projection neurons.</a> Curr. Biol. 12, 1877-1884 (2002).</li><li>Ng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+olfactory+information+between+three+populations+of+neurons+in+the+antennal+lobe+of+the+fly.">Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly.</a> Neuron. 36, 463-474 (2002).</li><li>Sachse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+plasticity+in+an+olfactory+circuit.">Activity-dependent plasticity in an olfactory circuit.</a> Neuron. 56, 838-850 (2007).</li><li>Pelz, D., Roeske, T., Syed, Z., de Bruyne, M., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+receptive+range+of+an+olfactory+receptor+in+vivo+&#40;Drosophila+melanogaster+Or22a&#41;.">The molecular receptive range of an olfactory receptor in vivo &#40;Drosophila melanogaster Or22a&#41;.</a> J. Neurobiol. 66, 1544-1563 (2006).</li><li>Silbering, A. F., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+odor+mixtures+in+the+Drosophila+antennal+lobe+reveals+both+global+inhibition+and+glomerulus-specific+interactions.">Processing of odor mixtures in the Drosophila antennal lobe reveals both global inhibition and glomerulus-specific interactions.</a> J. Neurosci. 27, 11966-11977 (2007).</li><li>Reiff, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies.">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li><li>Abuin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+olfactory+ionotropic+glutamate+receptors.">Functional architecture of olfactory ionotropic glutamate receptors.</a> Neuron. 69, 44-60 (2011).</li><li>Benton, R., Vannice, K. S., Gomez-Diaz, C., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+ionotropic+glutamate+receptors+as+chemosensory+receptors+in+Drosophila.">Variant ionotropic glutamate receptors as chemosensory receptors in Drosophila.</a> Cell. 136, 149-162 (2009).</li><li>Pelz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Functional characterization of Drosophila melanogaster Olfactory Receptor Neurons. , (2005).</li><li>Ai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+sensing+by+the+Drosophila+olfactory+system.">Acid sensing by the Drosophila olfactory system.</a> Nature. 468, 691-695 (2010).</li><li>Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Brain+Imaging:+Fluorescence+or+Bioluminescence,+Which+to+Choose?.">In Vivo Brain Imaging: Fluorescence or Bioluminescence, Which to Choose?.</a> Journal of Neurogenetics. , 1-23 (2008).</li><li>Jayaraman, V., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+a+genetically+encoded+optical+sensor+of+neural+activity+using+electrophysiology+in+intact+adult+fruit+flies.">Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies.</a> Front. Neural Circuits. 1, 3-3 (2007).</li><li>Pfeiffer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9715-9720 (2008).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I metodi di preparazione e di analisi descritte qui può essere utilizzato per analizzare i cattivi odori evocati risposte in una popolazione di neuroni nel lobo antennale (OSN, LN e PN) per il quale un transgene corrispondente driver è disponibile. Mentre descrivere la sua applicazione utilizzando un microscopio a fluorescenza, imaging ottico di questa preparazione può anche essere effettuata usando la microscopia confocale a due fotoni o 22,32. Infatti, questi strumenti ultime alleviare il problema di scattering di luce ad ampio campo di microscopia, che può ridurre la risoluzione delle immagini, specialmente quando un gran numero di neuroni esprimono il reporter. Questa preparazione consente registrazioni di solito i cattivi odori evocati risposte per almeno mezz&#39;ora, ma questa volta può essere significativamente più o meno lungo a seconda del numero e della lunghezza delle misurazioni registrate, il tempo di esposizione utilizzato per ogni fotogramma e la inter-stimolo intervallo. Inoltre, l&#39;eccitazione a due fotoni può ridurre photobleaching del fluorescente reporter, nonché fototossicità cellulare, per consentire la misurazione per periodi più lunghi 22,32. Indipendentemente dalla scelta del microscopio, il movimento del cervello mosca all&#39;interno della capsula testa è il problema più ricorrente quando l&#39;imaging in animali intatti. Mentre il movimento di correzione in grado di correggere problemi minori (passo 5.1), di solito è meglio solo per registrare dalle preparazioni altamente stabili. Strategie per ridurre gli artefatti di movimento includono: (i) corretto vincolare la proboscide della mosca con la spina dorsale cactus, (ii) immobilizzare le gambe del mosca fissando loro il palco con eicosane (prima al punto 2.6) (eicosane può essere fuso a ~ 37 ° C; usare un filo d&#39;argento per estendere e perfezionare la punta del saldatore per questo scopo), (iii) intaccare l&#39;esofago (visibile tra i nervi antennali) con le pinzette sottili. Oltre a G-CaMP1.6 qui utilizzato, un numero di versioni ottimizzate di G-CAMP indicatori di calcio e altri sono disponibili,che si differenziano nel loro rapporto segnale-rumore, la fluorescenza basale e dinamica temporale 12,28,33. La scelta precisa del sensore dovrebbe tener conto di tutte queste proprietà, il tipo di neuroni da analizzare e la questione biologica affrontata. Sensori di corrente segnalare le modifiche di calcio che correlano abbastanza bene con l&#39;azione potenziali 12,34, e la loro ulteriore miglioramento, insieme a un numero crescente di specifiche linee genetiche del driver 35 continuerà a migliorare il potenziale di imaging ottico di attività neurale in al volo intatto.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Fornitore </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Cactus colonna vertebrale </td><td> Giardinaggio, centro per </td><td></td><td> ~ 7 millimetri sottile lungo, non troppo flessibile </td></tr><tr><td> Colofonia </td><td> Strumento a corda negozio </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Due componenti di silicio </td><td> WPI </td><td> KWIK-SIL </td><td></td></tr><tr><td> Custom made blocco di montaggio in plexiglass </td><td> Blueprints disponibili <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Griglie di rame </td><td> Athene Griglie </td><td> G220-5 </td><td> Normalmente utilizzato per i campioni di microscopia elettronica. </td></tr><tr><td> Viti </td><td> Ferramenta </td&gt; <td></td><td> 2 mm di diametro </td></tr><tr><td> Coprioggetti plastica </td><td> Plano-em </td><td> L4193 </td><td> 22 X 22 mm </td></tr><tr><td> Punte di ferro di saldatura </td><td> Conrad Electronics </td><td> 830283-62 </td><td></td></tr><tr><td> Alimentazione regolamentato </td><td> Conrad Electronics </td><td> 511407-62 </td><td></td></tr><tr><td> Filo sottile </td><td> Isabellenhütte </td><td> Isa-ohm </td><td> 0,013 millimetri </td></tr><tr><td> Eicosane </td><td> Sigma </td><td> 21,927-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Zeiss </td><td> Axioexaminer D1 </td><td></td></tr><tr><td> CCD della fotocamera </td><td> Visitron </td><td> CoolSnap HQ </td><td></td></tr><tr><td> Metafluor </td><td> Visitron </td><td></td><td> Acquisizione software </td></tr><tr><td> Monocromatore </td><td> Visitron </td><td> Visichrome </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Lame fragili </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 10050-00 </td><td></td></tr><tr><td> Supporto per blade </td><td> WPI </td><td> 14134 </td><td></td></tr><tr><td> Sapphire blade </td><td> WPI </td><td> 500314 </td><td> Lama a doppio taglio 1 millimetro </td></tr><tr><td> Pompe a membrana gas </td><td> KNF Neuberger AG </td><td> NMP 830 KVE </td><td></td></tr><tr><td> Sapphire portalama </td><td> WPI </td><td> 500317 </td><td></td></tr><tr><td> Valvola a tre vie </td><td> Lee Azienda </td><td> LFAA1200118H </td><td> Configurazione E </td></tr><tr><td> Rotametro 500 ml / min </td><td> Analyt-MTC </td><td> 112-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Rotametro 5 L / min </td><td> Analyt-MTC </td><td> 102-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Cera vergine </td><td> SILADENT Technik </td><td> 209212 </td><td>; </td></tr><tr><td> Cellulosa pad </td><td> Kettenbach Medical </td><td> 31003 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzetta </td><td> Plano-em </td><td> T5130 </td><td> Dumont biologia # 5 </td></tr><tr><td> Siringhe </td><td> BD </td><td> 300928 </td><td> 2ml, Discardit II, 2pezzi </td></tr><tr><td> Aghi </td><td> Braun Sterican </td><td> 4665120 </td><td> 1,2 millimetri OD </td></tr></tbody></table>

calcium imaging of odor-evoked responses in the drosophila antennal lobe

Il lobo antenne è il centro principale olfattivo nel cervello insetti e rappresenta l&#39;equivalente anatomica e funzionale del bulbo olfattivo vertebrato 1-5. Informazioni olfattivo nel mondo esterno viene trasmessa al lobo antennale da neuroni sensoriali olfattivi (OSN), che segregano per regioni distinte neuropilo chiamati glomeruli secondo il recettore specifico olfattivo esprimono. Qui, OSN assoni sinapsi con entrambe le interneuroni locali (LNS), i cui processi possono innervare molti glomeruli diversi, e neuroni di proiezione (PN), che trasmettono informazioni olfattive ai maggiori regioni del cervello olfattive. Imaging ottico dell&#39;attività di OSN, LNS e PNS nel lobo antennale - tradizionalmente mediante indicatori sintetici di calcio (es. calcio verde, FURA-2) o la tensione-sensibili (ad esempio coloranti RH414) - è stata a lungo una tecnica importante per capire come olfattiva gli stimoli sono rappresentati come modelli spaziali e temporalidell&#39;attività glomerulare in molte specie di insetti 6-10. Sviluppo di geneticamente codificati reporter attività neurale, come gli indicatori di calcio fluorescenti G-Camp 11,12 e Cameleon 13, l&#39;indicatore di calcio bioluminescente GFP-equorina 14,15, o un reporter di trasmissione sinaptica, Synapto-pHluorin 16 ha reso sistema olfattivo del moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, particolarmente accessibile all&#39;imaging neurofisiologico, integrando le sue proprietà complessivamente descritte-molecolari, elettrofisiologici e neuroanatomici 2,4,17. I giornalisti possono essere selettivamente espressa tramite binari sistemi di controllo trascrizionale (es. GAL4/UAS 18, LexA / LexAop 19,20, Q del sistema 21) in popolazioni di neuroni definiti all&#39;interno del circuito olfattivo di sezionare con elevata risoluzione spaziale e temporale come odori evocati attività neurale è rappresentata, modulato e trasformato 22-24 &lt;/ Sup&gt;. Qui si descrivono i metodi di preparazione e di analisi per misurare i cattivi odori evocati risposte nel lobo antennale Drosophila utilizzando G-CAMP 25-27. La preparazione animale è minimamente invasiva e può essere adattato per l&#39;imaging mediante microscopia a fluorescenza, confocale e due fotoni a grande campo.

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Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Descriviamo una tecnica consolidata per misurare e analizzare i cattivi odori evocati risposte di calcio nel lobo antennale di vivere<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

Imaging di calcio di cattivi odori evocati risposte nel Drosophila Lobe antenne

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

calcium-imaging-odor-evoked-responses-drosophila-antennal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

25.8K Views.  University of Lausanne. Descriviamo una tecnica consolidata per misurare e analizzare i cattivi odori evocati risposte di calcio nel lobo antennale di vivere Drosophila melanogaster.

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Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.
Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex1. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group2. The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues3, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group4.
The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of &tilde;100&mu;m3 constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB5, 6, 7 which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.
Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

This article presents the protocols of intrinsic optical signals and flavoproteins autofluorescence signals imaging to map odor-evoked activities at the surface of the olfactory bulb in mice.

Le attività di imaging Odore-Evocati nel bulbo olfattivo del mouse utilizzando riflettanza ottica e segnali autofluorescenza

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Ricerca

Neuroscienze

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Le risposte di imaging neuronale in preparazione Fetta di organo vomeronasale Esprimere un sensore di calcio geneticamente codificato

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Calcio Risposte imaging in neuroni GFP-tagged fette di cervello di topo ipotalamici

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe

All organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is especially important in insects, which use their olfactory systems to respond to, and discriminate amongst, complex odor stimuli. These odors elicit behaviors that mediate processes such as reproduction and habitat selection1-3. Additionally, chemical sensing by insects mediates behaviors that are highly significant for agriculture and human health, including pollination4-6, herbivory of food crops7, and transmission of disease8,9. Identification of olfactory signals and their role in insect behavior is thus important for understanding both ecological processes and human food resources and well-being.
	To date, the identification of volatiles that drive insect behavior has been difficult and often tedious. Current techniques include gas chromatography-coupled electroantennogram recording (GC-EAG), and gas chromatography-coupled single sensillum recordings (GC-SSR)10-12. These techniques proved to be vital in the identification of bioactive compounds. We have developed a method that uses gas chromatography coupled to multi-channel electrophysiological recordings (termed 'GCMR') from neurons in the antennal lobe (AL; the insect's primary olfactory center)13,14. This state-of-the-art technique allows us to probe how odor information is represented in the insect brain. Moreover, because neural responses to odors at this level of olfactory processing are highly sensitive owing to the degree of convergence of the antenna's receptor neurons into AL neurons, AL recordings will allow the detection of active constituents of natural odors efficiently and with high sensitivity. Here we describe GCMR and give an example of its use.
	Several general steps are involved in the detection of bioactive volatiles and insect response. Volatiles first need to be collected from sources of interest (in this example we use flowers from the genus Mimulus (Phyrmaceae)) and characterized as needed using standard GC-MS techniques14-16. Insects are prepared for study using minimal dissection, after which a recording electrode is inserted into the antennal lobe and multi-channel neural recording begins. Post-processing of the neural data then reveals which particular odorants cause significant neural responses by the insect nervous system.
	Although the example we present here is specific to pollination studies, GCMR can be expanded to a wide range of study organisms and volatile sources. For instance, this method can be used in the identification of odorants attracting or repelling vector insects and crop pests. Moreover, GCMR can also be used to identify attractants for beneficial insects, such as pollinators. The technique may be expanded to non-insect subjects as well.

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings GCMR in the Insect Antennal Lobe

Olfactory cues mediate many different behaviors in insects, and are often complex mixtures comprised of tens to hundreds of volatile compounds. Using gas chromatography with multi-channel recording in the insect antennal lobe, we describe a method for the identification of bioactive compounds.

Identificazione dei volatili olfattive utilizzando la gas cromatografia-Multi-unit Recordings (GCMR) nel lobo antennale Insetto

All  organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their  behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

Ex Vivo Calcio Imaging per visualizzare le risposte del cervello alla segnalazione endocrina in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

In Vivo Optical Calcium Imaging della plasticità sinaptica indotta dall'apprendimento in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte function is not fully known. Pericytes have been suggested to be involved in capillary development, regulation of endothelial barrier tightness and trancytosis activity, regulation of capillary tone and to play crucial roles in certain brain pathologies.
Pericytes are challenging to investigate in the intact brain due to the difficulties in visualizing processes in the brain parenchyma, as well as the close proximity to the other cells of the NVU. The present protocol describes a method for isolation and culture of primary bovine brain capillary pericytes and their following usage in calcium imaging studies, where effects of agonists involved in brain signaling and pathologies can be investigated. Cortical capillary fragments are allowed to attach to the bottom of culture flasks and, after 6 days, endothelial cells and pericytes have grown out from the capillary fragments. The endothelial cells are removed by gentle trypsinization and pericytes are cultured for 5 additional days before passaging.
Isolated pericytes are seeded in 96-well culture plates and loaded with the calcium indicator dye (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) to allow for measurements of intracellular calcium levels in a plate reader setup. Alternatively, pericytes are seeded on coverslips and mounted in cell chambers. Following loading with the calcium indicator (Cal-520 AM), calcium live-imaging can be performed using confocal microscopy at an excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 510-520 nm.
The method described here has been used to obtain the first intracellular calcium measurements from primary brain capillary pericytes, demonstrating that pericytes are stimulated via ATP and are able to contract in vitro.

Brain capillary pericytes are essential players in the regulation of blood-brain barrier properties and blood flow. This protocol describes how brain capillary pericytes can be isolated, cultured, characterized with respect to cell type and applied for investigations of intracellular calcium signaling with fluorescent probes.

Coltura di periciti capillari cerebrali per misurazioni citosoliche del calcio e studi di imaging del calcio

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using calcium as a proxy for neuronal activity, these techniques provide a way to monitor the responses of individual cells within large neuronal ensembles to a variety of stimuli in real time. We, and others, have applied these techniques to image the responses of individual geniculate ganglion neurons to taste stimuli applied to the tongues of live anesthetized mice. The geniculate ganglion is comprised of the cell bodies of gustatory neurons innervating the anterior tongue and palate as well as some somatosensory neurons innervating the pinna of the ear. Imaging the taste-evoked responses of individual geniculate ganglion neurons with GCaMP has provided important information about the tuning profiles of these neurons in wild-type mice as well as a way to detect peripheral taste miswiring phenotypes in genetically manipulated mice. Here we demonstrate the surgical procedure to expose the geniculate ganglion, GCaMP fluorescence image acquisition, initial steps for data analysis, and troubleshooting. This technique can be used with transgenically encoded GCaMP, or with AAV-mediated GCaMP expression, and can be modified to image particular genetic subsets of interest (i.e., Cre-mediated GCaMP expression). Overall, in vivo calcium imaging of geniculate ganglion neurons is a powerful technique for monitoring the activity of peripheral gustatory neurons and provides complementary information to more traditional whole-nerve chorda tympani recordings or taste behavior assays.

Here we present how to expose the geniculate ganglion of a live, anesthetized laboratory mouse and how to use calcium imaging to measure the responses of ensembles of these neurons to taste stimuli, allowing for multiple trials with different stimulants. This allows for in depth comparisons of which neurons respond to which tastants.

Imaging in vivo del calcio delle risposte del neurone ganglio genicolato di topo agli stimoli del gusto

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Imaging del calcio nell'oliva inferiore del topo

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Valutazione dell'attività del calcio nello strato di cellule gangliari retiniche

Calcium Imaging In Electrically Stimulated Flat-Mounted Retinas

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the impaired light-sensing photoreceptor cells in the degenerated retina, aiming to partially restore vision by inducing visual percepts. One common avenue of investigation involves the design and production of implantable devices with a flexible physical structure, housing a high number of electrodes. This enables the efficient and precise generation of visual percepts. However, with each technological advancement, there arises a need for a reliable and manageable ex vivo method to verify the functionality of the device before progressing to in vivo experiments, where factors beyond the device's performance come into play. This article presents a comprehensive protocol for studying calcium activity in the retinal ganglion cell layer (GCL) following electrical stimulation. Specifically, the following steps are outlined: (1) fluorescently labeling the rat retina using genetically encoded calcium indicators, (2) capturing the fluorescence signal using an inverted fluorescence microscope while applying distinct patterns of electrical stimulation, and (3) extracting and analyzing the calcium traces from individual cells within the GCL. By following this procedure, researchers can efficiently test new stimulation protocols prior to conducting in vivo experiments.

Autore in primo piano: Un approccio innovativo alla stimolazione elettrica neurale utilizzando l'imaging del calcio 

Retinal prostheses have the ability to generate visual perceptions. To advance the development of new prostheses, ex vivo methods are needed to test devices before implantation. This article provides a comprehensive protocol for studying calcium activity in the retinal ganglion cell layer when subjected to electrical stimulation.

Imaging del calcio nelle retine piatte stimolate elettricamente

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the ...