Questo protocollo è significativo perché utilizza materiale per il paziente. Se il paziente ha la malattia, l'uso delle loro cellule dovrebbe riflettere più accuratamente la risposta biologica del paziente. Questa tecnica è semplice da eseguire, diretta e non richiede attrezzature sofisticate.
Questi metodi possono essere utilizzati per la diagnosi, ad esempio, per dimostrare che una mutazione RYR1 modifica funzionalmente l'omeostasi del calcio, nonché per testare la potenziale funzione terapeutica di un composto. A seconda delle conoscenze e delle competenze tecniche del singolo ricercatore, gli esperimenti di test devono essere eseguiti prima di utilizzare campioni di pazienti effettivi. Per monitorare i cambiamenti nella concentrazione intracellulare di calcio dei linfociti B trasformati in EBV, risospese le cellule B immortalizzate in una sola volta 10 alla settima cellula per millilitro di concentrazione nella soluzione di Krebs Ringer e Fura-2 AM a una concentrazione finale di cinque micromolari per un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius.
Alla fine dell'incubazione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospescere il pellet nella soluzione fresca di Krebs Ringer a una concentrazione di due volte 10-sesta cella per millilitro. Poco prima di iniziare l'esperimento, centrifugare nuovamente le cellule e risospese rapidamente le cellule in 1,5 millilitri della soluzione di Krebs Ringer integrata con EGTA 0,5 millimolari ma senza calcio aggiunto. Trasferire le celle in una cuvetta spettrofluorometrica di vetro da tre millilitri e registrare il rapporto di fluorescenza su uno spettrofluorometro dotato di un agitatore magnetico impostato alla massima velocità e 37 gradi Celsius per circa 30 secondi.
Per valutare la risposta al rilascio di calcio in singole cellule, placcare una volta 106 celle caricate Fura-2 AM in un millilitro della soluzione di Krebs Ringer integrate con cloruro di calcio monomillimolare su singoli scivoli di copertura in vetro rivestito con poli-L-lisina e incubare gli scivoli di copertura a 37 gradi Celsius in un incubatore di colture cellulari umidificate per 30 minuti. Quando le cellule si sono attaccate, posizionare una copertura in una camera di perfusione e iniziare a perfondere le cellule a due millilitri di soluzione di Krebs Ringer integrata con una portata di calcio millimolare al minuto. Utilizzando un microscopio fluorescente invertito dotato di un obiettivo di immersione in olio 40 volte e dei filtri appropriati, registrare le misurazioni online con un dispositivo di collegamento per fotocamera ad accoppiamento di carica controllato da software a intervalli di un secondo, a un tempo di esposizione fisso.
Per ottenere la stimolazione cellulare, utilizzare uno stimolatore di perfusione cellulare con 12 valvole per aggiungere le diverse concentrazioni di agonista. Per isolare i miotubi dalle biopsie muscolari umane, prima risciacquare la biopsia con PBS sterile per rimuovere il sangue in eccesso prima di tritare il tessuto in piccoli frammenti da 0,5 a un millimetro. Posizionare due o tre frammenti in singoli inserti in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti contenente 1,5 millilitri di terreno di crescita muscolare umano per pozzetto e 500 microlitri di mezzo per inserto e posizionare la piastra nell'incubatore di colture cellulari.
Per misurare i cambiamenti nell'espressione del calcio nei miotubi umani, quando si possono osservare miotubi multinucleati, sostituire i supernatanti della coltura di miotubi con un mezzo di differenziazione fresco integrato con 10 microlitri di Fura-2 AM monomillolare per un'incubazione di 30 minuti nell'incubatore di colture cellulari. Al termine dell'incubazione, trasferire una coltura di copertura di vetro nella camera di perfusione e risciacquare le cellule con la soluzione di Krebs Ringer integrata con cloruro di calcio a due millimolari. Quindi eseguire misurazioni del calcio online come dimostrato utilizzando un obiettivo di immersione in acqua 20 volte.
In questa analisi rappresentativa, è stato osservato un rapido aumento del calcio nei linfociti B immortalizzati EBV dopo l'aggiunta di agonista che lentamente è diminuito a livelli di riposo nel tempo. In un esperimento simile, l'aggiunta di thapsigargin 400-nanomolare ha causato un grande transitorio di calcio che ha raggiunto un valore di fluorescenza di picco di 2,4 unità arbitrarie. Questo valore di fluorescenza è stato considerato al 100% quando è stata costruita la corrispondente curva dose-risposta.
In questa analisi, le cellule B immortalizzate sono state stimolate con caffeina a cinque millimolari per 20 secondi, con conseguente aumento immediato del rapporto di fluorescenza di 340 e 380 nanometri. Per ogni concentrazione di caffeina testata, è stato calcolato il picco indotto dalla caffeina nel rapporto di 340 per 380 nanometri di fluorescenza e utilizzato per costruire una curva di risposta alla dose. Il rilascio di calcio da miotubi differenziati può anche essere valutato in risposta al lavaggio con cloruro di potassio, diverse concentrazioni di agonista e / o caffeina e possono essere generate curve di risposta alla dose normale.
È importante assicurarsi che le celle siano caricate correttamente con Fura-2 e che entrambe le lunghezze d'onda di 340 e 380 nanometri rispondano all'aggiunta dell'agonista. Le misurazioni intracellulari del calcio con indicatori fluorescenti di calcio possono essere studiate nella maggior parte delle cellule di mammifero e possono essere applicate allo studio dei cambiamenti intracellulari del calcio in risposta a diversi stimoli.
