This work was supported by the grant P01HL107151 from the NHLBI/NIH. The authors also gratefully acknowledge the support and access to instrumentation provided through grant P41GM103490 from the NIGMS/NIH.

NOTA: Le preoccupazioni di sicurezza di laboratorio In linea con le migliori prassi standard di laboratorio, osservare quanto segue. Conservare tutti i solventi organici nelle posizioni appropriate. Conservare tutti i materiali di scarto in contenitori per rifiuti chimici con una chiara etichettatura di composizione chimica. Come diversi reagenti utilizzati in questi protocolli sono potenziali agenti cancerogeni o generare gas infiammabili volatili, gestire tutti i reagenti in una cappa aspirante con ventilazione. Indossare dispositivi di protezione individuale, come guanti, camice da laboratorio e occhiali di protezione quando si lavora con solventi organici. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51840/51840fig1highres.jpg" width="450px" /> Figura 1. Procedura per in-gel O-glycomics. (A) Le proteine ​​di interesse sono risolte mediante SDS-PAGE, rilevato da adeguate procedure di colorazione Coomassie (o argento), e asportati. Pezzi di gel asportati vengono affettatidadini, decolorato, e lavato con acetato di etile per ridurre i contaminanti che interferiscono con successiva analisi MS. Una parte della fetta gel può essere riservato a in-gel digestione trittico e la successiva caratterizzazione proteomica mediante LC-MS / MS. (B) glicani O-linked vengono rilasciati da glicoproteine ​​risolti da in-gel riduttivo β-eliminazione. Passi essenziali includono la dissalazione e la rimozione borato da azeotropo con metanolo. (C) glicani rilasciati da riduttiva β-eliminazione O-linked sono permethylated e successivamente diviso in fasi acquose e organiche. Sulfoglycans sono quantitativamente recuperati nella fase superiore (acquosa) mentre glicani neutri e sialylated partizione in quella inferiore (DCM) strato. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51840/51840fig2highres.jpg" width="700px" /> Figura 2. Particolare diagramma di flusso per glycomics in-gel. Ogni speriTal passo mostrato in figura 1 è illustrata singolarmente. (A) decolorazione di gel ed estrazione EtOAc, (B) direttamente in-gel riduttivo β-eliminazione per il rilascio glicani O-linked, e (C) permethylation e la fase di partizione. <a href="/files/ftp_upload/51840/51840fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande della figura.</a> 1. Gel escissione e rimozione di contaminanti Gel-derivati <ol><li> Prima di iniziare la procedura, preparare i prodotti chimici e reagenti elencati nella Lista dei materiali. </li><li> Risolvere proteine ​​in SDS-PAGE gel con sistemi tampone Tris-Glycine standard. Stain proteine ​​sia con Coomassie Brilliant Blue o argento Stain risolto. In generale, il recupero di glicani O-linked di argento colorato gel è di circa 80-90% del recupero ottenuto da Coomassie macchiato gel. </li><li> Dopo l&#39;elettroforesi, posizionare il gel su una lastra di vetro e accise tegli regione di interesse con un bisturi pulito o lama di rasoio. </li><li> Per aumentare la resa di O-glicani, trasferire la band gel di interesse su un&#39;altra lastra di vetro e tagliare il pezzo di gel asportato in cubetti di circa 2 mm. Evita di fare pezzi di gel inferiori a 1 mm cubi, perché il recupero glicano si riduce. Trasferire i piccoli pezzi di gel in un tubo di vetro con tappo a vite (13 x 100 mm) con microspatula in acciaio inox. </li><li> Aggiungere 1 ml di 25 mM di bicarbonato di ammonio (AMBIC, NH 4 HCO 3) alla provetta, tappare la provetta di vetro con un tappo a vite rivestita di teflon, e mescolare delicatamente muovendo il tubo prima di lasciare riposare per 10 min. Non impiegare vigorosa agitazione per evitare lo strappo dei pezzi di gel. </li><li> Rimuovere con cautela AMBIC dal tubo di vetro utilizzando una pipetta di vetro Pasteur o una pipetta dotato di una punta in plastica extra-lunga. Evitare distruggendo e il trasferimento dei piccoli pezzi di gel durante la rimozione della soluzione AMBIC. </li><li> Aggiungere 1 ml di acetonitrile (ACN) per latubo di vetro, tappo, e mescolare delicatamente muovendo il tubo prima di lasciare riposare per 10 min. Assicurarsi che i pezzi di gel sono completamente coperti con del solvente. Se necessario, spingere pezzi di gel al largo della parete del tubo e in un solvente con la punta della pipetta. </li><li> Pipettare ACN fuori dal tubo di vetro e ripetere i passaggi 1,5-1,7 fino a quando il colore blu brillante viene eliminato. Ripetere un minimo di cinque lavaggi sequenziali AMBIC / ACN, se necessario. Per argento macchiato gel, utilizzare un kit Decolorare. Procedere alla fase successiva quando il pezzo di gel diventa uniformemente bianco mentre in ACN. </li><li> Pipettare il liquido dal tubo di vetro, richiudere la provetta, aggiungere 1 ml di AMBIC e lasciare riposare per 5 minuti. </li><li> Rimuovere AMBIC e aggiungere 2 ml di acetato di etile (EtOAc) al tubo di vetro. Recap tubo con tappo rivestita di teflon e posto a 4 ° C per una notte con l&#39;agitazione end-over-end o, in alternativa effettuare tre lavaggi EtOAc a temperatura ambiente per 30 minuti ciascuno. Più lungo è il lavaggio EtOAc, il più efficace la rimozione di contaminanti. </li><li> Rimuoverela finale EtOAc lavare ed eseguire tre lavaggi ciascuna con 2 ml di H 2 O. La rimozione completa di EtOAc garantirà una robusta reazione β-eliminazione riduttiva. </li><li> Pipettare off H 2 O e disidratare il gel lavando una volta con 1 ml di ACN. NOTA: Dopo l&#39;essiccazione, i gel disidratati sono pronti per in-gel β-eliminazione. Pezzi di gel disidratati possono essere conservati a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Arrestare il processo di lavaggio ad ogni passo e memorizzare i pezzi di gel a 4 ° C per una notte, indipendentemente dal tampone o soluzione viene applicata al gel (AMBIC, ACN, H 2 O). Riavviare la preparazione dei campioni in qualunque momento entro i prossimi 2 giorni. </li><li> Utilizzare una parte dei pezzi di gel decolorato e disidratati per ID proteine ​​mediante approcci di proteomica standard. </li></ol> 2. In-gel O-glicani uscita da riduttiva β-eliminazione <ol><li> Preparare una soluzione stock di 1 M di idrossido di sodio (NaOH) utilizzando il 50% di NaOH o solido deposito NaOH ed a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. <ol&gt; <li> Prendere 5.2 ml di NaOH al 50% (o 4 g di NaOH solido) e regolare il volume a 100 ml di rendere soluzione 1 M di NaOH. Diluire la soluzione madre 1 M NaOH NaOH 100 mM, che può essere conservato a 4 ° C fino a 6 mesi senza perdita di efficienza nelle reazioni β-eliminazione riduttiva. </li></ol></li><li> Fai 2 M boroidruro di sodio (NaBH4) in NaOH 100 mM. Disciogliere 38 mg di NaBH 4 in 0,5 ml di NaOH 100 mM. Generalmente, utilizzare 0,5-1,0 ml della soluzione di boroidruro per ogni campione. Variare il volume della soluzione di reazione della quantità di pezzi di gel secchi preparati nel passaggio 1. aspettano di utilizzare 0,5 ml di soluzione di boroidruro per 1-2 pezzi di gel escisse (passo 1.3). </li><li> Aggiungere 500 ml di NaOH 100 mM per i pezzi di gel disidratato e lasciare riposare per 3-5 minuti in ghiaccio, al fine di equilibrare il gel per le condizioni di base che aumentano il recupero glicani. </li><li> Aggiungere 500 ml di 2 M NaBH4 in NaOH 100 mM, con concentrazioni finali di 1 M NaBH <sub&gt; 4 in NaOH 100 mM. Mescolare delicatamente il tubo e incubare a 45 ° C per 18 ore. <ol><li> Durante la prima ora di incubazione, mescolare delicatamente il tubo ogni 15 min. Evitare di forte agitazione, perché può frammentare i pezzi di gel. Eseguire la reazione in un ben equilibrato-incubatore / forno o in un blocco riscaldante. Assicurarsi che i pezzi di gel sono coperte di soluzione di reazione. </li></ol></li><li> Arrestare la reazione rimuovendo la provetta dal termostato o il blocco di riscaldamento e l&#39;immissione sul ghiaccio. NOTA: Dopo aver lasciato la reazione di β-eliminazione di procedere per 18 ore, il processo di dissalazione deve essere eseguita entro il giorno stesso. </li></ol> 3. Desalting on-scambio cationico cromatografia <ol><li> Pur mantenendo la provetta in ghiaccio per evitare formazione eccessiva di calore, aggiungere lentamente 10% di acido acetico (AcOH) goccia a goccia per neutralizzare la base. Vortice lentamente la provetta tra le aggiunte di AcOH. Fare attenzione a aggiungere l&#39;acido lentamente e rilasciare saggio come additisu di acido produrrà un &quot;vulcano&quot; di bolle. Centrifugare la provetta per eliminare le bolle e prevenire ricaduta, se necessario. <ol><li> Al fine di eliminare la grande quantità di sodio nella miscela di reazione, passare la miscela di reazione attraverso una piccola colonna di scambio cationico (o Dowex AG-50W-X8 resina, forma H +). </li><li> Lavare la resina a scambio cationico con 1 M NaOH e 1 M HCl prima dell&#39;uso per rimuovere i contaminanti che interferiscono con l&#39;analisi MS, anche se la resina è di grado analitico. </li><li> Bagnare la resina in 1 M NaOH e rimuovere la soluzione per decantazione. Aggiungi deionizzata, eliminare l&#39;acqua, quindi aggiungere 1 M HCl. </li></ol></li><li> Ripetere questi passaggi fino a quando la soluzione di cui sopra la resina è incolore. Lavare la resina pulita con acqua deionizzata e conservare in 5% AcOH a 4 ° C. </li><li> Per fare un piccolo bicchiere di colonna, graffi e rompere la punta di un vetro pipetta Pasteur con un taglierino in ceramica in modo che il cono del puntale è di circa 1 cm di lunghezza. Tease parte un tappo di lana di vetro e spingere verso la punta forma un supporto per il letto di resina. Fissare la colonna pipetta con un morsetto o molletta e posizionare sopra una provetta di vetro. </li><li> Lavare la pipetta vuota con 1 ml di metanolo (MeOH) e 3 ml di 5% AcOH. Turbinio H + Dowex o AG50 scambio cationico liquami memorizzati in 5% AcOH e trasferire abbastanza dello slurry per produrre un volume di 1 ml letto nella colonna pipetta Pasteur. </li><li> Lavare la colonna con cinque volumi del 5% AcOH. Controllare il flusso attraverso la comparsa di particelle di resina e non utilizzare la colonna in caso di rilevamento di resina. </li><li> Mettere colonna su un nuovo tubo tappo a vite in vetro (16 x 125 mm) e il campione del carico. Raccogliere il flusso attraverso ed eluire glicani con almeno 3 volumi di 5% AcOH nella stessa provetta. </li><li> Coprire il tubo con parafilm e fare piccoli fori con un ago. Inserire il tubo campione a -80 ° C o in ghiaccio secco. Una volta congelato, essiccare il campione mediante liofilizzazione. Conservare il materiale essiccato a -20 °C fino all&#39;utilizzo. </li></ol> 4. Rimozione borato <ol><li> Preparare 10% AcOH in MeOH. Prendere 10 ml di acido acetico glaciale e regolare il volume a 100 ml con metanolo. Conservare questo reattivo in una bottiglia di vetro con tappo in teflon foderato per un massimo di 6 mesi. </li><li> Aggiungere 300 ml di 10% AcOH in MeOH a secco, tubo campione liofilizzato e agitare. Rimuovere la risultante trimetil borato mediante evaporazione in corrente di N 2. NOTA: Miscelazione sali borato con metanolo in condizioni acide produce trimetil borato che è un composto volatile. </li><li> Secco sotto flusso di N 2 a 37 ° C. Dopo l&#39;essiccazione, aggiungere un&#39;altra aliquota di AcOH in MeOH come descritto al punto 4.2. Essiccare il liquido per 5 min sotto azoto (N 2) flusso a 37 ° C. <ol><li> Ripetere risospensione e l&#39;essiccazione di almeno 3 volte. Conservare il materiale essiccato a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li></ol> 5. C18 Clean-up <ol><li> Equilibrare una colonna cartuccia C18(Dimensioni 1 ml, 100 mg di resina) con tre volumi di ACN, e cinque volumi del 5% AcOH. Accelerare il passaggio delle soluzioni equilibratrici mediante l&#39;applicazione di pressione d&#39;aria positiva mite. </li><li> Aggiungere 500 ml di 5% AcOH alla provetta dissalato e senza borato e sciogliere dal vortice. </li><li> Caricare campione risospeso nella colonna C18 equilibrata e raccogliere il flusso attraverso in una provetta con tappo a vite di vetro (13 x 100 mm). Eluire O-glicani con 3 ml di 5% AcOH nella stessa provetta. </li><li> Parafilm il tubo, fare piccoli fori con un piccolo ago o utilizzare il tappo rivestito in PTFE liberamente chiusa per coprire il tubo, e congelare il campione a -80 ° C o in ghiaccio secco. Rimuovere il solvente mediante liofilizzazione. Conservare il campione essiccato a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 6. Preparazione Base per Permethylation NOTA: Al fine di raggiungere robusta permethylation, preparare NaOH liquame fresco. Tutta la vetreria utilizzata per le reazioni permethylation dovrebbe essere ampiamente pulito. <ol><li> Per preparare il reagente base per permethylation, aggiungere 400 ml di NaOH al 50% in una provetta con tappo a vite vetro pulito (13 x 100 mm). Aggiungere 800 ml di MeOH anidro e vortice. </li><li> Aggiungere 4 ml di anidra dimetil solfossido (DMSO) e agitare per generare un precipitato bianco. </li><li> Centrifugare a 600 xg per 1 minuto per far sedimentare il precipitato. Pipettare il surnatante e gettarlo. Aggiungere un ulteriore 4 ml di DMSO anidro al pellet. Vortex. </li><li> Ripetere il punto 6.2 e 6.3 almeno altre tre volte o fino a quando non forma un precipitato bianco. </li><li> Sciogliere la base di pellet in 3 ml di DMSO anidro e mescolare delicatamente pipettando su-e-giù con una pipetta Pasteur pulito. </li><li> Utilizzare la base immediatamente per la reazione seguente permethylation quanto non può essere conservato. </li></ol> 7. Permethylation di glicani rilasciati <ol><li> Aggiungere 200 ml di DMSO anidro al campione C18-purificato e vortice o agli ultrasuoni per riportare in sospensione. </li><li> Aggiungere 300 ml di resuspended base di liquami al campione e aggiungere immediatamente 100 ml di iodometano (MEI). Sigillare tubo con tappo rivestita di teflon e mescolare energicamente per 5 minuti in vortice. </li><li> Per interrompere la reazione permethylation, aggiungere 2 ml di 5% AcOH su ghiaccio e vortex. Pipetta soluzione su e giù 5 volte a ridurre il volume rimanente di Mei per evaporazione. NOTA: Il HoAc neutralizza la soluzione e la rimozione di Mei aumenta l&#39;efficienza di estrazione di glicani solfatati nella fase acquosa durante la fase di partizione. </li><li> Aggiungere 2 ml di diclorometano (DCM) e vortex. Centrifugare a 600 xg per 1 minuto a temperatura ambiente per separare le fasi acquosa e organica. </li><li> Trasferire lo strato superiore (fase acquosa che contiene la maggior parte dei glicani solfatati permethylated) in un nuovo tubo di vetro (13 x 100 mm). </li><li> Aggiungere 2 ml di H 2 O per la fase organica e vortice. Centrifugare a 600 xg per 1 min per separare le fasi acquosa e organica e combinare questa seconda fase acquosa con l&#39;abetest fase acquosa (punto 7.5). </li><li> Ripetere la fase 7.6 e 7.5 altre tre volte, ma non vi è alcuna necessità di salvare le fasi acquose risultanti dalle partizioni successive. </li><li> Rimuovere lo strato finale superiore (fase acquosa) il più possibile dallo strato inferiore (fase organica) e trasferire lo strato inferiore (fase organica) in una nuova provetta separata utilizzando pulito pipetta Pasteur. </li><li> Asciugare la fase organica in N 2 flusso a 42 ° C. </li><li> Coprire il tubo con Parafilm e conservare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 8. C18 Clean-up di Permethylated solfatate O-glicani dalla fase acquosa <ol><li> Equilibrare una colonna cartuccia C18 con tre volumi di ACN, e cinque volumi del 5% AcOH. </li><li> Caricare le fasi acquose raccolti e combinati dalle fasi 7.5 e 7.6 nella colonna. </li><li> Lavare la colonna con 10 ml di H 2 O per la dissalazione. </li><li> Eluire il permethylated solfato O-glicani in un nuovo tubo di vetro con 2 mldel 50% ACN. Utilizzare un ulteriore eluizione con l&#39;85% ACN per migliorare il recupero di permethylated solfati O-glicani su oligosaccaridi più grandi. </li><li> Eluati a secco sotto flusso di azoto a 42 ° C. </li><li> Conservare il materiale essiccato a -20 ° C fino a 6 mesi prima dell&#39;analisi MS. </li></ol> 9. Spettrometria di Massa di Permethylated O-glicani <ol><li> Analizzare permethylated O-glicani mediante infusione diretta in un spettrometro di massa appropriato utilizzando una sorgente nanoelectrospray ad una portata siringa ,40-,60 microlitri / min a 210 ° C di temperatura capillare. Per frammentazione CID in MS / MS e MS n di uno strumento trappola ionica, applicare il 30-40% di energia di collisione. </li><li> Per la modalità di ioni negativi, ricostituire permethylated solfato O-glicani in 50 ml di metanolo / 2-propanolo / 1-propanolo / 13 mM di acetato di ammonio acquoso (16: 3: 3: 2 in volume). Per la modalità di ioni positivi, ricostituire permethylated / sialylated O-glicani neutri in 50 ml di 1 mM di sodio idroidrossido in metanolo / acqua (1: 1). </li><li> Utilizzare la mappatura totale di ioni (TIM) e la scansione perdita del neutro (scansione NL) funzionalità della versione del pacchetto software Xcalibur 2.0 per l&#39;analisi MSN a caratterizzare singole strutture O-glicani 13,19. </li></ol>

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M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+developmental+elaboration+of+N-linked+glycan+complexity+in+the+Drosophila+melanogaster+embryo.">Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo.</a> J. Biol. Chem. 282 (12), 9127-9142 (2007).</li><li>Domon, B., Costello, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Systematic+Nomenclature+for+Carbohydrate+Fragmentations+in+Fab-Ms+Ms+Spectra+of+Glycoconjugates.">A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates.</a> Glycoconj. J. 5 (4), 397-409 (1988).</li><li>Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+1.+Mining+structural+details+by+MSn.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).</li><li>Lapadula, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+3.+OSCAR:+an+algorithm+for+assigning+oligosaccharide+topology+from+MSn+data.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).</li><li>Ashline, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+structural+isomers+analyzed+by+sequential+mass+spectrometry.">Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).</li><li>Thomsson, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+salivary+mucin+MG1+(MUC5B)+carries+a+repertoire+of+unique+oligosaccharides+that+is+large+and+diverse.">The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse.</a> Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).</li><li>Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+techniques+and+strategic+workflow+for+sulfoglycomics+based+on+mass+spectrometry+mapping+and+sequencing+of+permethylated+sulfated+glycans.">Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans.</a> Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).</li><li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+mass+spectrometry-based+sulfoglycomic+mapping+for+identification+of+terminal+sulfated+lacdiNAc+glycotope.">Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope.</a> Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).</li><li>Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+&#946;-elimination+and+aqueous-organic+partition+for+improved+O-+and+sulfoglycomics.">In-gel &#946;-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics.</a> Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).</li></ol>

The authors declare no competing financial interest.

Combining in-gel reductive &#946;-elimination with aqueous-organic extraction enhances the sensitivity and depth of structural data that can be acquired for characterizing sulfated and non-sulfated O-linked glycans harvested from small amounts of mucin-type glycoproteins resolved from other proteins by SDS-PAGE. The essential advances of the technical approaches presented in this study are: (a) facile removal of gel derived contaminants by simple washing steps; (b) quantitative recovery of permethylated sulfoglycans in t...

La glicosilazione è una proteina post-traduzionale modifica essenziale, contribuendo alla fisiologia organismal, patologia dei tessuti, e il riconoscimento cellulare 1-3. Nonostante i grandi progressi nella glicoscienza analitica, che caratterizza la diversità completa di glicani su una specifica proteina rimane un compito estremamente impegnativo, soprattutto sulle proteine ​​isolate da fonti biologiche primarie. Tuttavia, la microeterogeneità di glicani glicoproteina interessa frequentemente interazioni funzionali con altre proteine. Pertanto, la caratterizzazione della diversità glycan è essenziale per comprendere il significato fisiologico di cellulare e tissutale glicosilazione 4,5. Per comprendere il contributo della glicoproteina glicosilazione alla fisiologia dei tessuti e fisiopatologia, robusto, sensibile, e tecniche analitiche glycomic globali sono diventati sempre più importanti. In analisi proteomica, identificazione di proteine ​​sono in genere raggiunti da LC-MS/ Analisi MS di peptidi triptici 6. Proteina digestione può essere effettuata con una proteina o proteine ​​purificate risolto mediante SDS-PAGE dopo digestione in gel con proteasi quali tripsina 7-9. Pre-arricchimento della miscela proteica mediante SDS-PAGE migliora la profondità e la precisione di ID proteine. Lo sviluppo di strategie analoghe per l&#39;analisi glycomic della glicoproteina glicosilazione si trova in prima linea glicoscienza. I due principali classi di glicani sono attaccati alla backbone della proteina sia attraverso N-linkage o O-linkage. Glicani N-linked sono collegati a asparagina (Asn) residui presenti come parte di un sequon definita come Asn-X-Ser / Thr / Cys (X è un qualsiasi amminoacido prolina eccezione), e può essere rilasciato per digestione enzimatica con peptide- N -glycanase (PNGaseF o A), sia in soluzione, in gel, oppure on-blot 10-12. Glicani O-linked sono collegate principalmente alla serina (Ser) e treonina (Thr) residui. Tuttavia, solo un enzima è stato idenficato che è in grado di rilasciare glicani O-linked dalla glicoproteina e ha una specificità glicani estremamente limitata, rilasciando solo i semplici glicani O-linked. Strategie di rilascio di sostanze chimiche rimangono il metodo di scelta per il rilascio completo di glicani O-linked da glicoproteine. Β-eliminazione riduttiva o non riduttiva, o idrazinolisi sono tecniche di rilascio chimico ben caratterizzati e sono attualmente i metodi più comunemente usati per il rilascio glicani O-linked da glicoproteine ​​13,14. Sebbene riduttivo β-eliminazione è stato usato per rilasciare glicani O-linked da glicoproteine ​​separate mediante SDS-PAGE, approcci precedenti necessari separazione HPLC per la successiva analisi 15-17. Multidimensionale MS (MS n) analisi attualmente fornisce la fonte più ricca di dati strutturali per la caratterizzazione di glicani rilasciati da glicoproteine ​​isolate negli importi previsti dalla maggior parte delle fonti biologiche. La profondità della SMbasata caratterizzazione strutturale è notevolmente facilitata da permethylating i glicani rilasciati prima della loro analisi. Permethylation migliora la ionizzazione e tende a livellare le risposte di segnale molari in una vasta gamma di strutture glycan 18,19. Inoltre, permethylation tag senza ambiguità frazioni monosaccaridi terminali e sostituiti con masse distintivi, rafforzando in tal modo delucidazione strutturale 20-23. Ad esempio, glicani acidi sono generalmente difficili da rilevare come specie non-permethylated da MS. Sebbene glicani acidi possono essere rilevati in modalità ioni negativi da MS, è impossibile rilevare sia glicani acidi e neutri nella stessa modalità ioni. Uno dei principali vantaggi di permethylation glycan è che tutti i gruppi idrossilici liberi (OH) su sostituenti monosaccaridi di un glycan sarà limitato con un gruppo metilico (OCH 3 o OME), in tal modo gli oneri a sialylated di glicani sono neutralizzati, che li rende come rilevabile come permethylated neutro (asiaLO) glicani. Tuttavia, gli idrossili di frazioni solfato di sulfoglycans sono resistenti permethylation, con conseguente ritenzione di carica anionica, che sopprime ionizzazione e diminuisce la sensibilità. Questa soppressione attualmente impedisce un&#39;analisi completa glycomic di glicoproteine ​​molto complessi come mucine, che trasportano una grande abbondanza di glicani solfati 24-26. Recenti rapporti sulla depurazione solfato glicani hanno usato pagano, cromatografia a fase inversa per purificare e glicani permethylated separati prima dell&#39;analisi MALDI. Questo metodo si basa sulla completa separazione dei glicani solfati e non solfati utilizzando diverse fasi mobili per l&#39;eluizione, che abbiamo trovato ad essere meno rigorosi di organico partizionamento fase. Pertanto, le nuove tecniche adatte per la rilevazione e l&#39;arricchimento di sulfoglycans sono qui presentati. Queste tecniche consentono il recupero quantitativo dei glicani solfatate in fase acquosa segue acqua: DCM (diclorometano)estrazione, che viene normalmente eseguita al termine di reazioni permethylation glycan 27. È importante sottolineare che questo robusto separazione tra sulfoglycans permethylated da una miscela di glicani non solfati permethylated arricchisce in concomitanza per le specie cariche ma anche di semplificare MS 2 modelli di frammentazione. Un protocollo completo per una migliore analisi glicani in gel-O-linked è anche presentato. Il protocollo migliorata migliora il recupero glicani, aumenta le informazioni strutturali ottenibili tramite MS n analisi dei glicani permethylated, e migliora la sensibilità delle analisi sulfoglycomic applicate a glicoproteine ​​essenziali isolati da fonti biologiche. Questo protocollo è destinato O-glicani legati analisi di estratti glicoproteina interi o di una specifica glicoproteina di interesse risolto mediante SDS-PAGE e si compone di tre procedure sperimentali; A) Gel clean-up, B) in-gel riduttivo β-eliminazione, e C) permethy glycanmento. L&#39;obiettivo è quello di ottenere dati completi O-linked glycomic per glicoproteine ​​raccolti dalle fonti primarie di interesse biologico (Figura 1). Glicoproteine ​​separate mediante SDS-PAGE sono visibili con la colorazione e bande di interesse sono asportato e la band gel risultante viene tagliata a piccoli pezzi. I pezzi di gel sono decolorato e sottoposti a lavaggi acetato di etile per rimuovere i contaminanti gel (Figura 2A). Rilascio Glycan si ottiene in gel riduttivo β-eliminazione (Figura 2B) ed i glicani rilasciati sono permethylated. Acquosa-organico estrazione secondo permethylation partizioni quantitativamente le anionici solfato glicani lontano da glicani neutri non solfati (Figura 2C). Nel gel riduttivo β-eliminazione accoppiato ad estrazione acquoso-organici permette la caratterizzazione di glicani e sulfoglycans O-linked rilasciate da piccole quantità di glicoproteina separati mediante SDS-PAGE. La visione strategica è summarized nella figura 1 ed i dettagli sono mostrati in Figura 2. Inoltre, una parte dei pezzi di gel decolorato e lavati può essere utilizzato per l&#39;identificazione di proteine ​​mediante tecniche di proteomica LC-MS / MS standard.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:124px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:303px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:231px;">Water, deionized water</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>270733-4L</td>
			<td style="width:303px;">CHROMASOLV, for HPLC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Acetic acid, Glacial</td>
			<td style="width:155px;">Fisher</td>
			<td>A38-500</td>
			<td style="width:303px;">Certified ACS&#8805;99.7 w/w %</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Methanol</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>34860-4L-R</td>
			<td style="width:303px;">CHROMASOLV, for HPLC, &#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:155px;">Fluka</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td style="width:303px;">BioUltra, &#8805;99.5% (T), Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>34998-4L</td>
			<td style="width:303px;">CHROMASOLV Plus, for HPLC, &#8805;99.9%, Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:155px;">Fluka</td>
			<td>34972-1L-R</td>
			<td style="width:303px;">LC-MS CHROMASOLV, Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Sodium borohydride</td>
			<td style="width:155px;">Aldrich</td>
			<td>213462-25G</td>
			<td style="width:303px;">ReagentPlus, 99%, Step 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Iodomethane</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>289566-100G</td>
			<td style="width:303px;">ReagentPlus, 99.5%,&#160; Step 6.&#160; Store at 4 &#176;C until use.&#160; Sit at room temperature before use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Sodium hydroxide solution, 50% w/w</td>
			<td style="width:155px;">Fisher</td>
			<td>SS254-1</td>
			<td style="width:303px;">Certified, Step 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Dimethyl sulfoxide, anhydrous</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>276855-1L</td>
			<td style="width:303px;">Anhydrous, &#8805;99.9%, Step 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Methanol, anhydrous</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>322415-100ML</td>
			<td style="width:303px;">Anhydrous, 99.8%, Step 6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Dichloromethane</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>34856-4L</td>
			<td style="width:303px;">CHROMASOL&#174;, for HPLC, &#8805;99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:231px;">Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200&#160;mesh</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>217506-500G</td>
			<td style="width:303px;">Step 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">AG 50W-X8 Resin&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td>142-1441</td>
			<td style="width:303px;">Step 3</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:231px;">BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase</td>
			<td style="width:155px;">JT Baker</td>
			<td>JT-7020-01</td>
			<td style="width:303px;">Step 5 and 8</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td style="width:303px;">Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Bio-Safe Coomassie Stain&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td>161-0786</td>
			<td style="width:303px;">G-250, Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Silver Stain Kit for Mass Spectrometry</td>
			<td style="width:155px;">Pierce</td>
			<td>24600</td>
			<td style="width:303px;">Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140)</td>
			<td style="width:155px;">Supelco&#160;</td>
			<td>47265</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135)</td>
			<td style="width:155px;">Supelco&#160;</td>
			<td>47265</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes</td>
			<td style="width:155px;">Corning</td>
			<td>99447-13</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes</td>
			<td style="width:155px;">Corning</td>
			<td>99447-16</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner</td>
			<td style="width:155px;">Kimble</td>
			<td>45066C-13</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner</td>
			<td style="width:155px;">Kimble</td>
			<td>45066C-15</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton HPLC syringe</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>81265</td>
			<td style="width:303px;">volume 500&#160;&#956;L, needle size 22 ga&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton HPLC syringe</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>81165</td>
			<td style="width:303px;">volume 250&#160;&#956;L, needle size 22 ga</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton HPLC syringe</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>81065</td>
			<td style="width:303px;">volume 100&#160;&#956;L, needle size 22s ga&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton HPLC syringe</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>80965</td>
			<td style="width:303px;">volume 50&#160;&#956;L, needle size 22s ga</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hamilton Calibrated Syringes</td>
			<td style="width:155px;">HAMILTON</td>
			<td>80300</td>
			<td style="width:303px;">volume 10&#160;&#956;L, needle size 26s ga&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">Petri Dish Glass 100mm x 15mm</td>
			<td style="width:155px;">GSC INTERNATIONAL INC</td>
			<td>1500-4</td>
			<td style="width:303px;">Wash before use, Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Bard-Parker Surgical Blades</td>
			<td style="width:155px;">Fisher</td>
			<td>371310</td>
			<td style="width:303px;">Step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Reacti-Therm Heating/Stirring Module</td>
			<td style="width:155px;">Pierce</td>
			<td>18870</td>
			<td style="width:303px;">Step 1, 4 and 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Heating Blocks</td>
			<td style="width:155px;">Fisher</td>
			<td>125D</td>
			<td style="width:303px;">Step 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8&#160;&#956;m</td>
			<td style="width:155px;">Aldrich</td>
			<td>CLS3950</td>
			<td style="width:303px;">Step 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Fused Silica CutterTubing cutter</td>
			<td style="width:155px;">alltech</td>
			<td>3194</td>
			<td style="width:303px;">Step 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Multi-tube vortexers&#160;</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>444-7063</td>
			<td style="width:303px;">Step 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Lyophilizer 25EL Freezemobile</td>
			<td style="width:155px;">Virtis</td>
			<td>25EL</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>Clinical 50</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">LTQ Orbitrap Discovery</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td style="width:303px;">0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved in-gel reductive &#946;-elimination for comprehensive o-linked and sulfo-glycomics by mass spectrometry

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of biological samples. Similar approaches, that would allow in-depth analysis of the glycans carried by glycoproteins resolved by SDS-PAGE, require special considerations in order to maximize recovery and sensitivity when using mass spectrometry (MS) as the detection method. A major hurdle to be overcome in achieving high-quality data is the removal of gel-derived contaminants that interfere with MS analysis. The sample workflow presented here is robust, efficient, and eliminates the need for in-line HPLC clean-up prior to MS. Gel pieces containing target proteins are washed in acetonitrile, water, and ethyl acetate to remove contaminants, including polymeric acrylamide fragments. O-linked glycans are released from target proteins by in-gel reductive &#946;-elimination and recovered through robust, simple clean-up procedures. An advantage of this workflow is that it improves sensitivity for detecting and characterizing sulfated glycans. These procedures produce an efficient separation of sulfated permethylated glycans from non-sulfated (sialylated and neutral) permethylated glycans by a rapid phase-partition prior to MS analysis, and thereby enhance glycomic and sulfoglycomic analyses of glycoproteins resolved by SDS-PAGE.

Effetto di acetato di etile Trattamento Prima di In-gel riduttiva β-eliminazione Uno spettro di massa di campioni rappresentativi glicani O-linked permethylated rilasciati da bovini mucina utilizzo nel gel riduttivo β-eliminazione è mostrato in Figura 3. Il lavaggio EtOAc dei pezzi di gel rimuove efficacemente SDS e Polyacryl contaminanti che interferiscono con successiva analisi MS 27. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="...

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Improved In-gel Reductive &amp;#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

In order to comprehensively explore the diversity of O-linked glycans, a new procedure for in-gel reductive &#946;-elimination, combined with permethylation and a rapid phase-partition method, is applied to the analysis of O-linked glycans directly released from glycoproteins resolved by SDS-PAGE and amenable to subsequent glycomic analysis by mass spectrometry.

Miglioramento in gel riduttive solfo-glycomics β-eliminazione completa per O-linked e di spettrometria di massa

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

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Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. The approach offers an unbiased and in-depth analysis that can enable the development of diagnostic tests, novel therapies, and further our understanding of disease processes. The inherent chemical diversity of the metabolome creates significant analytical challenges and there is no single experimental approach that can detect all metabolites. Additionally, the biological variation in individual metabolism and the dependence of metabolism on environmental factors necessitates large sample numbers to achieve the appropriate statistical power required for meaningful biological interpretation. To address these challenges, this tutorial outlines an analytical workflow for large scale non-targeted metabolite profiling of serum by UPLC-MS. The procedure includes guidelines for sample organization and preparation, data acquisition, quality control, and metabolite identification and will enable reliable acquisition of data for large experiments and provide a starting point for laboratories new to non-targeted metabolite profiling by UPLC-MS.

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. This article outlines a typical workflow utilized for non-targeted metabolite profiling of serum including sample organization and preparation, data acquisition, data analysis, quality control, and metabolite identification.

Su larga scala e non mirato Profiling Metabolomica di siero da Ultra Performance Liquid Chromatography-Spettrometria di Massa (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

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Chimica

A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

In this study we evaluated a method for the characterization of complexes, formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptide, by electrospray ionization orbitrap mass spectrometry. This strategy is based on previous successful characterization of mercury-dicysteinyl complexes involving tripeptides by utilizing mass spectrometry among other techniques. Mercury(II) chloride and a dicysteinyl tetrapeptide were incubated in a degassed buffered medium at varying stoichiometric ratios. The complexes formed were subsequently analyzed on an electrospray mass spectrometer consisting of a hybrid linear ion- and orbi- trap mass analyzer. The electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) spectra were acquired in the positive mode and the observed peaks were then analyzed for distinct mercury isotopic distribution patterns and associated monoisotopic peak. This work demonstrates that an accurate stoichiometry of mercury and peptide in the complexes formed under specified electrospray ionization conditions can be determined by using high resolution ESI MS based on distinct mercury isotopic distribution patterns.

A Study of the Complexation of MercuryII with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

The characterization of complexes formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptides by electrospray ionization orbitrap mass spectrometry is presented.

Uno studio della Complessazione di Mercurio (II) con Dicysteinyl Tetrapeptidi da Electrospray ionizzazione Spettrometria di Massa

In this study we evaluated a method for the characterization of complexes, formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptide, ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

Analisi dell'espirato in tempo reale tramite ionizzazione secondaria Nanoelectrospray accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

Sintesi e analisi di spettrometria di massa di Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

Analisi di architetture di proteine e complessi proteina-ligando mediante spettrometria di massa strutturale integrativa

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

Sorveglianza dei medicinali ad alta produttività e completa usando la spettrometria totale multisegmento elettroforesi di iniezione-capillare

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass spectrometry (MS) of complex molecules and their reactions on surfaces. DINeC is based on a beam of SO2 clusters impacting on the sample surface at low cluster energy. During cluster-surface impact, some of the surface molecules are desorbed and ionized via dissolvation in the impacting cluster; as a result of this dissolvation-mediated desorption mechanism, low cluster energy is sufficient and the desorption process is extremely soft. Both surface adsorbates and molecules of which the surface is composed of can be analyzed. Clear and fragmentation-free spectra from complex molecules such as peptides and proteins are obtained. DINeC does not require any special sample preparation, in particular no matrix has to be applied. The method yields quantitative information on the composition of the samples; molecules at a surface coverage as low as 0.1 % of a monolayer can be detected. Surface reactions such as H/D exchange or thermal decomposition can be observed in real-time and the kinetics of the reactions can be deduced. Using a pulsed nozzle for cluster beam generation, DINeC can be efficiently combined with ion trap mass spectrometry. The matrix-free and soft nature of the DINeC process in combination with the MSn capabilities of the ion trap allows for very detailed and unambiguous analysis of the chemical composition of complex organic samples and organic adsorbates on surfaces.

Neutral SO2 clusters of low kinetic energy (&#60; 0.8 eV/constituent) are used to desorb complex surface molecules such as peptides or lipids for further analysis by means of mass spectrometry using an ion trap mass spectrometer. No special sample preparation is required, and real-time observation of reactions is possible.

Analisi delle molecole complesse e delle loro reazioni sulle superfici mediante mezzi di desorpazione/spettrometria di massa indotta da cluster

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the past decade. Interest in the bio-nano interface arises from the fact that the biomolecular corona confers a biological identity to NMs and thus causes the body to identify them as &#8220;self&#8221;. For example, previous studies have demonstrated that the proteins in the corona are capable of interacting with membrane receptors to influence cellular uptake and established that the corona is responsible for cellular trafficking of NMs and their eventual toxicity. To date, most research has focused upon the protein corona and overlooked the possible impacts of the metabolites included in the corona or synergistic effects between components in the complete biomolecular corona. As such, this work demonstrates methodologies to characterize both the protein and metabolite components of the biomolecular corona using bottom-up proteomics and metabolomics approaches in parallel. This includes an on-particle digest of the protein corona with a surfactant used to increase protein recovery, and a passive characterization of the metabolite corona by analyzing metabolite matrices before and after NM exposures. This work introduces capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry (CESI-MS) as a new technique for NM corona characterization. The protocols outlined here demonstrate how CESI-MS can be used for the reliable characterization of both the protein and metabolite corona acquired by NMs. The move to CESI-MS greatly decreases the volume of sample required (compared to traditional liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (LC-MS) approaches) with multiple injections possible from as little as 5 &#181;L of sample, making it ideal for volume limited samples. Furthermore, the environmental consequences of analysis are reduced with respect to LC-MS due to the low flow rates (&#60;20 nL/min) in CESI-MS, and the use of aqueous electrolytes which eliminates the need for organic solvents.

Here we present a protocol to characterize the complete biomolecular corona, proteins, and metabolites, acquired by nanomaterials from biofluids using a capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry approach.

Approcci di spettrometria di massa per elettroforesi capillare per la caratterizzazione della proteina e del metabolita Corona acquisiti da nanomateriali

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool for this purpose, especially for protein systems that are difficult to study by traditional methods. To study a protein&#39;s structure by MS, specific chemical reactions are performed in solution that encode a protein&#39;s structural information into its mass. One particularly effective approach is to use reagents that covalently modify solvent accessible amino acid side chains. These reactions lead to mass increases that can be localized with residue-level resolution when combined with proteolytic digestion and tandem mass spectrometry. Here, we describe the protocols associated with use of diethylpyrocarbonate (DEPC) as a covalent labeling reagent together with MS detection. DEPC is a highly electrophilic molecule capable of labeling up to 30% of the residues in the average protein, thereby providing excellent structural resolution. DEPC has been successfully used together with MS to obtain structural information for small single-domain proteins, such as &#946;2-microglobulin, to large multi-domain proteins, such as monoclonal antibodies.

The experimental procedures for performing diethylpyrocarbonate-based covalent labeling with mass spectrometric detection are described. Diethylpyrocarbonate is simply mixed with the protein or protein complex of interest, leading to the modification of solvent accessible amino acid residues. The modified residues can be identified after proteolytic digestion and liquid chromatography/mass spectrometry analysis.

Etichettatura covalente con dietilpirocarbonato per lo studio della struttura proteica di ordine superiore mediante spettrometria di massa

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...

Characterizing RNA Modifications in Single Neurons Using Mass Spectrometry

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous system (CNS). Recent evidence has linked specific neuronal RNA modifications to learning and memory paradigms. Unfortunately, conventional methods for the detection of these epitranscriptomic features are only capable of characterizing highly abundant RNA modifications in bulk tissues, precluding the assessment of unique PTM profiles that may exist for individual neurons within the activated behavioral circuits. In this protocol, an approach is described&#8212;single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry (SNRMA-MS)&#8212;to simultaneously detect and quantify numerous modified ribonucleosides in single neurons. The approach is validated using individual neurons of the marine mollusk, Aplysia californica, beginning with surgical isolation and enzymatic treatment of major CNS ganglia to expose neuron cell bodies, followed by manual single-neuron isolation using sharp needles and a micropipette. Next, mechanical and thermal treatment of the sample in a small volume of buffer is done to liberate RNA from an individual cell for subsequent RNA digestion. Modified nucleosides are then identified and quantified using an optimized liquid chromatography-mass spectrometry method. SNRMA-MS is employed to establish RNA modification patterns for single, identified neurons from A. californica that have known morphologies and functions. Examples of qualitative and quantitative SNRMA-MS are presented that highlight the heterogeneous distribution of RNA modifications across individual neurons in neuronal networks.

Post-transcriptional modifications of RNA represent an understudied layer of translation regulation that has recently been linked to central nervous system plasticity. Here, sample preparation and liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach is described for simultaneous characterization of numerous RNA modifications in single neurons.

Caratterizzazione delle modifiche dell'RNA in singoli neuroni utilizzando la spettrometria di massa

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous ...