Gli autori ringraziano il Prof. M. Dietel e Dirk Schumacher per sostenere questo lavoro e criticamente la lettura del manoscritto. La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto il sostegno del innovativi in ​​materia di medicinali impresa comune ai sensi della convenzione di sovvenzione n ° 115234, le risorse di cui sono composte di partecipazione finanziaria del Settimo programma quadro dell&#39;Unione europea (FP7/2007-2013) e le imprese &#39;in dell&#39;EFPIA contributo di natura. Questo lavoro è stato supportato anche dal Krebsgesellschaft Berliner (BKG).

La struttura generale della dell&#39;esperimento compresa la preparazione di singole cellule primarie da tessuto tumorale, la caratterizzazione della coltura di cellule primarie, deplezione fibroblasti e cell sorting magnetico di CD133 + e CD133 - cellule di melanoma è mostrato in Figura 1. 1. Esempio di acquisizione <ol><li> Verificare la presenza di approvazione etica prima di considerare i passi successivi. </li><li> Preparare un tubo da 50 ml con PBS sterile supplementato con 1% di penicillina-streptomicina concentrazione finale e la consegna di un intervento chirurgico o di squadra. </li><li> Organizza il trasporto veloce di tessuto tumorale da un intervento chirurgico al laboratorio di coltura cellulare a 4 ° C. </li></ol> 2. Preparazione primarie Melanoma singole cellule da tessuto tumorale <ol><li> Eseguire tutte le operazioni in condizioni sterili. </li><li> Prima resezione del tumore, si ha la necessità di preparare l&#39;impasto dissociazione. 10 ml mix dissociazione a 2-4 g di tessuto è richiesto. La miscela può essere utilizzata immediapletamente o conservati in aliquote da 10 ml a -20 ° C per un uso successivo. <ol><li> Preparare una soluzione contenente cloruro di sodio 150 mM. Mescolare con un vortice fino a quando la soluzione è limpida. Se necessario, filtrato sterile di cloruro di sodio usando un filtro di 0,22 micron. </li><li> Pesare DNasi I e preparare una soluzione contenente 10 mg / ml DNasi I in cloruro di sodio 150 mM. Mescolare capovolgendo finché la soluzione è limpida. </li><li> Preparare una soluzione contenente 100mg/ml Collagenase IV in PBS. Mescolare capovolgendo finché la soluzione è limpida. Aliquote di soluzione di collagenasi può essere conservato a -20 ° C per diversi mesi. </li><li> Preparare l&#39;impasto dissociazione con una concentrazione finale di 1% Penicillina-Streptomicina, 1 mg / ml di collagenasi IV e 0,1 mg / ml in terreno di DNasi I Quantum 263. Mescolare con un vortice. Opzionale: quando si usa il tessuto derivato dalla soluzione di melanoma cutaneo aggiuntivo Amfotericina B al mix dissociazione ad una concentrazione finale di 1,5 mg / ml di amfotericina B. </li></ol></li><li> Preriscaldare il reqquantità uired di dissociazione mix, PBS e Quantum medie 263-37 ° C. </li><li> Luogo tessuto tumorale su una piastra di Petri sterile. Aspirare la soluzione in eccesso dal tessuto e aggiungere 500 microlitri mix dissociazione. Tritare tumore in piccoli pezzi di 2-4 mm con l&#39;utilizzo freschi, bisturi sterili. </li><li> Trasferimento 2-4 g macinata tessuto tumorale in un tubo gentleMACS C contenente 5 ml mix dissociazione. Sciacquare piastra Petri con l&#39;aggiunta di 4,5 ml di dissociazione mescolare e aggiungere frammenti di tessuto rimasti alla metropolitana gentleMACS C. </li><li> Chiudi gentleMACS tubo C e collegarlo a testa in giù sulla bussola del dissociatore gentleMACS. Eseguire il programma gentleMACS &quot;h_tumor_01&quot;. </li><li> Staccare il tubo gentleMACS C dal dissociatore e incubare il campione per 30 min a 37 ° C in rotazione continua utilizzando il rotatore tubo MACSmix sulla velocità massima corsa (12 rpm) o ruotando il tubo manualmente ogni 5 minuti per risospendere frammenti di tessuto regolate . </li><li> Fissare gentleMACS tubo C a testa in giù sulla manica della tegli gentleMACS dissociatore ed eseguire il programma gentleMACS &quot;h_tumor_02&quot;. </li><li> Staccare il tubo gentleMACS C dal dissociatore e incubare il campione per 30 min a 37 ° C in rotazione continua utilizzando il rotatore tubo MACSmix sulla velocità massima corsa (12 rpm) o ruotando il tubo manualmente ogni 5 minuti per risospendere frammenti di tessuto regolate . </li><li> Fissare gentleMACS tubo C a testa in giù sulla bussola del dissociatore gentleMACS ed eseguire il programma gentleMACS &quot;h_tumor_03&quot;. </li><li> Staccare il tubo gentleMACS C dal campione dissociatore, risospendere e applicare la sospensione cellulare ad un filtro 70 micron cella posta su un tubo da 50 ml. Se intasamento del filtro avviene, mescolare sospensione cellulare con una punta sterile filtro fino alla completa sospensione attraversava. </li><li> Sciacquare filtro cella con 5 ml di mezzo Quantum 263. </li><li> Opzionale: se avete ancora frammenti di tessuto rimasti nel filtro, frammenti risospendere in mezzo Quantum 263 e semi in una cultura display appropriato cellulareh. Frammenti incubare a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Eliminare filtro cella e chiudere il tubo da 50 ml con la sospensione cellulare digerito. Centrifugare sospensione di cellule per 5 minuti a 300 xg ed eliminare il surnatante. </li><li> Opzionale: se la cella pellet viene visualizzato in rosso a causa di una elevata quantità di eritrociti preparare 1x Red Cell Lysis Solution sangue diluendo 1:10 soluzione 10x in acqua bidistillata, risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di PBS e si aggiungono 5 ml di 1x Red Lysis Globulo Soluzione. 5 sec vortice e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Centrifugare per 5 minuti a 300 xg ed eliminare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule tumorali con Quantum 263 e semi le cellule in coltura cellulare pallone adeguato. Cellule tumorali Cultura a 37 ° C e 5% di CO 2 e di routine delle cellule di passaggio quando raggiungono l&#39;80% confluenza. </li></ol> 3. Caratterizzazione di coltura cellulare primaria e deplezione dei fibroblasti <ol><li> Analizzare coltura primaria cellule fenotipicamente utilizzando un microscope. </li><li> Raccogliere una piccola quantità (0.5x 10 6 celle) della coltura cellulare primaria ed eseguire RT-PCR con primer per-neoplastiche, melanoma, cellule staminali-e geni marcatori delle cellule dello stroma. I geni più importanti da analizzare sono CD90 (marcatore dei fibroblasti), TYR (melanoma / marcatore melanociti), CD133 (marcatore delle cellule staminali del cancro), CD83 (marcatore di cellule dendritiche mature) e un gene housekeeping (ad esempio HPRT o GAPDH). </li><li> Se l&#39;analisi microscopica e alta espressione di CD90 Durante la RT-PCR ha rivelato una elevata contaminazione della cultura melanoma primitivo con fibroblasti, è necessario esaurire fibroblasti con gli Anti-Fibroblasti microsfere e colonne D da Miltenyi. </li></ol> 4. Di separazione delle cellule CD133 + magnetica e CD133 - cellule di melanoma utilizzando colonne LS <ol><li> Preparare MACS tampone contenente 2 mM EDTA e il 5% FCS in PBS. Miscelare invertendo e tampone sterile, filtrato con un micron 0,22 Steritop-GP Unità di filtro. Freddo del tampone a 4-8 ° Ce Degas prima dell&#39;uso. </li><li> Preriscaldare Accutase, PBS e Quantum medie 263-37 ° C. </li><li> Lavare 80% cellule confluenti con PBS. Aggiungere la quantità appropriata di Accutase e incubare cellule fino staccarsi dalla superficie cultura. Raccogliere le cellule in una provetta da 50 ml usando Quantum media 263. </li><li> Determinare il numero di cellule e centrifugare il numero di cellule (secondo il protocollo Miltenyi di un numero massimo di 2x 10 9 cellule possono essere caricati per colonna LS. Linea cellulare numeri specifici ottimale dovrebbe essere determinata e può essere notevolmente inferiore.) Per 5 min a 300 xg e 4-8 ° C. Aspirare il surnatante completamente. </li><li> Risospendere un massimo di 1x 10 8 cellule con 350 microlitri di buffer MACS (per il numero di cellule superiore scalare tutti i buffer successivo MACS, reagente FcR blocco, CD133/1-Biotin e anti-biotina microsfere volumi di conseguenza). </li><li> Aggiungere 100 Reagente FcR blocco. </li><li> Aggiungere 50 microlitri CD133/1-Biotin. Mescolare bene con un vortice e incubare a 4-8 ° C fo 10 min. </li><li> Lavare le cellule aggiungendo 10 ml tampone MACS e centrifugare per 5 min a 300 xg e 4-8 ° C. Aspirare il surnatante completamente. </li><li> Ripetere il passaggio di lavaggio (4.8) </li><li> Risospendere il pellet di cellule con 400 microlitri di buffer MACS. </li><li> Aggiungere 100 ml anti-biotina microsfere. Mescolare accuratamente con un vortex e incubare a 4-8 ° C per 15 min. </li><li> Nel frattempo, preparare il separatore MACS per la separazione magnetica. Fissare QuadroMACS a Separator MACS supporto Multi. Inserire il numero di colonne LS con le ali colonna al fronte nel campo magnetico del QuadroMACS. Inserire un pre-filtro di separazione (30 mesh con um nylon) in ciascuna colonna LS ed un tubo di raccolta appropriato (15 ml o 50 ml) sotto ciascuna colonna. Preparare filtro e colonna risciacquo con 3 ml di tampone MACS. Scartare a flusso continuo. </li><li> Lavare le cellule aggiungendo 10 ml tampone MACS e centrifugare per 5 min a 300 xg e 4-8 ° C. Aspirare il surnatante completamente. </li><li> Risospendere le cellule con 500 microlitriMACS tamponare e applicare sospensione cellulare nella colonna LS con il Pre-filtro di separazione. </li><li> Lavare tre volte con 3 ml di tampone per colonna MACS. Solo aggiungere nuovo buffer quando il serbatoio colonna è vuota. </li><li> La residua raccolta contiene il totale senza etichetta CD133 - frazione di cellule. </li><li> Gettare il pre-filtro di separazione, rimuovere colonna dal separatore e posizionarlo su un tubo di raccolta adeguato. </li><li> Applicare 5 ml di tampone MACS. Sciacquare immediatamente le cellule CD133 + marcati con fermezza spingendo lo stantuffo nella colonna. </li><li> Per aumentare la purezza della frazione negativa, applicare sospensione cellulare in una nuova colonna LS equilibrata inserito nel QuadroMACS. L&#39;effluente contiene il CD133 - frazione. </li><li> Elimina colonne. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Al fine di rimuovere contaminazioni eritrocitari dal pellet cellulare tumorale si consiglia di utilizzare la soluzione di globuli rossi del sangue lisi da Miltenyi. I vantaggi di lisare gli eritrociti rispetto alla tradizionale centrifugazione in gradiente di densità Ficoll sono che è più veloce e più semplice. Inoltre, contaminazioni con Ficoll o globuli rossi e la perdita di cellule tumorali sono evitati. Quando si osserva la crescita dei fibroblasti in coltura cellulare primaria devono essere rimossi immediatamen...

Cutanee melanomi maligni sono il tipo meno comune, ma più mortale di cancro della pelle. A causa di un aumento dei casi, un alto grado di malignità e di una rapida diffusione, melanomi ora rappresentano il 75% dei tumori maligni della pelle correlate 1,2 morti. Oltre l&#39;asportazione chirurgica del tumore primitivo, chemioterapia, radioterapia, immunoterapia e combinati chemio-immunoterapia del melanoma e metastasi sono state-of-the-art di strategie per il trattamento del melanoma 3,4. Tuttavia, il melanoma maligno è caratterizzato da una scarsa risposta a chemioterapici (5-12%), 5,6, e solo quelli il 50-70% dei pazienti affetti da melanoma che trasportano il gene BRAF V600E beneficio mutazione da promettenti nuove terapie mirate, come il trattamento con vemurafenib 7 Per migliorare la sopravvivenza complessiva, una migliore comprensione dei meccanismi di tumorigenesi melanoma è necessario. Per studiare questi meccanismi in passato, consolidata commerlinee cellulari cialmente disponibili sono stati utilizzati. Approcci più recenti per studiare gli eventi molecolari di iniziazione e la progressione del cancro utilizzare colture primarie derivate direttamente dal tessuto tumorale - un cuscinetto molteplici vantaggi strategici: Il ricercatore ha il pieno controllo del paziente e selezione dei tessuti. Le cellule campionate acquisita sapientemente selezionato tessuto tumorale, assomigliano il tumore con tutta la sua eterogeneità e follow-up dei dati del paziente e un dettagliato patologia è disponibile per consentire le caratteristiche della cultura per essere confrontati con quelli del tumore originale 8. Al contrario, l&#39;utilizzo di linee cellulari stabilizzate come sistemi modello nella ricerca sul cancro è discusso polemicamente. Già nel 1987 Osborne e colleghi hanno descritto significative differenze biologiche tra MCF-7 linee di cellule di cancro al seno umano da diversi laboratori 9. Questa instabilità genomica ampia variazione e l&#39;espressione di RNA durante sottocultura era confirmed da Hiorns et al. e ha fornito i dati di supporto per le prove del fatto che le linee di cellule si evolvono nella cultura, indebolendo in tal modo la rilevanza diretta delle culture così stabiliti come modelli di cancro umano 10. Un&#39;altra considerazione importante, che è stata largamente ignorata nel corso degli anni, è il rischio di contaminazione o di crescita eccessiva di culture con estranei &quot;falsi&quot; delle cellule, che è stato evidenziato più di venti anni fa, dimostrando che un gran numero di linee cellulari sono stati contaminati da HeLa cellule 8,11. L&#39;errata interpretazione dei dati di &quot;falsi&quot; linee cellulari è recentemente venuto alla luce nella letteratura di nuovo. Utilizzando una combinazione di DNA profiling e citogenetica molecolare, MacLeod et al. Rivelato che su 252 nuovi tumori derivati ​​da linee cellulari umane depositato presso la Collezione tedesca di microrganismi e colture cellulari (DSMZ), circa il 18% sono risultati intraspecie o interspecie croce -contaminanti 12,13. Per evitare questi problemi e di sfruttare i vantaggi di cui sopra, abbiamo deciso di stabilire basso passaggio da linee cellulari di melanoma metastasi asportati recentemente. Robuste cellule tecnologie di separazione e di analisi richiedono monocellulari preparati da generare contemporaneamente limitando la morte cellulare e la distruzione delle proteine ​​di superficie caratteristici. Uno strumento da banco per la dissociazione automatico di tessuti in sospensioni monocellulari è il dissociatore gentleMACS prodotto da Miltenyi. Quando usato in combinazione con gentleMACS C Tubi e ottimizzato soluzioni dissociazione, una dissociazione efficace e delicata del tessuto tumorale in un sistema chiuso viene raggiunto mantenendo epitopi antigenici e riducendo la perdita delle cellule. Lo strumento dispone ottimizzati, programmi preimpostati per una varietà di applicazioni specifiche e garanzie preparazione standardizzata di sospensioni monocellulari di melanoma tessuto 14. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Studi recenti hanno rivelato che la maggior parte dei tumori porto una piccola sottopopolazione di cellule tumorali cosiddette staminali (CSC), che presentano esclusivamente tumore inizia e si auto-rinnovano capacità. L&#39;identificazione di melanociti che producono cellule staminali nel derma della pelle ha portato a formulare l&#39;ipotesi che queste cellule potrebbero essere l&#39;origine delle cellule staminali tumorali (CSC) nel melanoma, perché l&#39;esposizione alle radiazioni UVA possono innescare queste cellule per la trasformazione maligna 15. Il risultato di tale lesione genetica sarebbe cellule che ospitano una combinazione di tumore e le caratteristiche delle cellule staminali. Uno degli indicatori chiave proposti per rappresentare la sottopopolazione di CSC nel melanoma è CD133 16-20. CD133 (noto anche come Prominin 1), un membro di glicoproteine ​​transmembrana pentaspan, viene espressa in cellule staminali ematopoietiche, cellule progenitrici endoteliali, cellule staminali neuronali e gliali 21-23. Espressione di CD133 è correlata condivisione cellulare asimmetrica 24, e l&#39;epitopo glicosilata del CD133 è dimostrato downregulated sulla differenziazione cellulare 25. Recentemente, CD133 + cellule di melanoma hanno mostrato di avere auto-rinnovamento e tumore iniziazione capacità di 19,20. Per studiare la funzione di CD133 + putativo melanoma CSC, abbiamo modificato e ottimizzato la magnetico selezione delle cellule attivate (MACS) sistema da Miltenyi Biotech per ottenere popolazioni altamente arricchito e vitale di CD133 + e CD133 - cellule. Magnetica tallone basata separazione cellulare permette a ciascuna selezione negativa, come mostrato da Matheu et al. 26 o selezione positiva, come indicato,. Durante la selezione positiva il particolare tipo di cellula bersaglio, ad esempio, le cellule che esprimono CD133, è magneticamente etichettato con microsfere, 50-nm particelle superparamagnetiche che sono coniugati ad anticorpi altamente specifici nei confronti di unparticolare cellula antigene di superficie. Durante la separazione, le cellule marcate magneticamente sono trattenute all&#39;interno della colonna nel campo magnetico del separatore, mentre le cellule non marcate fluire attraverso. Seguendo fasi di lavaggio, la colonna viene rimosso dal campo magnetico del separatore, e le cellule bersaglio vengono eluite dalla colonna. Il LS o colonne MS utilizzata durante la selezione risultato positivo in frazioni di cellule marcate e non marcato con elevata purezza. D&#39;altra parte, colonne LD, utilizzati per la selezione negativa, risultato in una purezza leggermente inferiore della frazione etichettato. A causa della densa confezionamento di loro matrice portata in queste colonne è inferiore a un rischio più elevato di celle non etichettati da intrappolati nella colonna. Colonne LD deve pertanto essere utilizzato solo per l&#39;esaurimento rigorosa di una sottopopolazione cellulare indesiderata. Selezione positiva può essere eseguita direttamente (anticorpo accoppiato a microsfere) o indiretto marcatura magnetica (incubazione con microsfere seguito incubation con l&#39;anticorpo primario). MACS specifici microperline sono disponibili per la selezione positiva di numerosi tipi di cellule primarie di cellule tumorali come prostatico o melanoma 27.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> L11-007 </td><td></td></tr><tr><td> Amfotericina B soluzione 250 mg / ml in acqua deionizzata </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> A2942-50ml </td><td></td></tr><tr><td> anti-fibroblasti microsfere </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-050-601 </td><td></td></tr><tr><td> CD133 / 1 (W6B3C1) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-092-395 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi IV </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> C5138 </td><td></td></tr><tr><td> DNasi I </td><td> , Ltd </td><td> A3778.0050 </td><td></td></tr><tr><td> D-PBS senza Ca, Mg </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> H15-002 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Etilendiammintetraacetato sale disodico diidrato (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> E-7889 </td><td></td></tr><tr><td> FBS Superior </td><td> Biochrom </td><td> S0615 </td><td></td></tr><tr><td> Indiretta CD133 Micro-Bead Kit umano </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-091-895 </td><td> Include: CD133 / 1 (AC133)-biotina, anti-biotina microsfere e il reagente FcR blocco </td></tr><tr><td> Penicillina-Streptomicina, liquido (100x) </td><td> Invitrogen GmbH </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Quantum 263 </td><td> PAA Laboratories GmbH </td><td> U15-815 </td><td></td></tr><tr><td> Blood Red Cell Lysis Solution (10x) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-094-183 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Attrezzatura </td></tr><tr> &lt;td&gt; Cell filtro (70 micron) </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS C Tubi </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS dissociatore </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> MACS Separator Supporto Multi </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-042-303 </td><td></td></tr><tr><td> Colonne di separazione MACS 25 colonne LS </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> MACSmix Tubo Rotator </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-090-753 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> Merck KGaA </td><td> 567440-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Pre-Filtri di separazione </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-041-407 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> QuadroMACS separatore </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> 130-090-976 </td><td></td></tr><tr><td> Rotilabo-siringa filtri (0.22 micron, PSE) </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co. KG </td><td> P668.1 </td><td></td></tr><tr><td> Steritop-GP filtro 500 ml </td><td> Miltenyi Biotec GmbH </td><td> SCGPS05RE </td><td></td></tr></tbody></table>

patient derived cell culture and isolation of cd133+ putative cancer stem cells from melanoma

Nonostante il miglioramento delle opzioni di trattamento per il melanoma oggi disponibili, pazienti con melanoma maligno ancora hanno una prognosi sfavorevole per la sopravvivenza libera da progressione e globale. Pertanto, la ricerca traslazionale ha bisogno di fornire altre prove per migliorare le terapie molecolari mirate per i melanomi maligni. In passato, i meccanismi oncogenici correlate a melanoma sono stati ampiamente studiati in linee cellulari stabilizzate. Sulla strada per regimi di trattamento più personalizzati basati su profili genetici individuali, si propone di utilizzare paziente linee cellulari derivate invece di linee cellulari generici. Insieme con i dati clinici di elevata qualità, in particolare sul follow-up, queste cellule sarà determinante per comprendere meglio i meccanismi molecolari alla base della progressione del melanoma. Qui, si segnala l&#39;istituzione di colture primarie di melanoma sezionato tessuto tumorale fresco. Questa procedura include macinazione e la dissociazione del tessuto in cellule singole, rerimozione di contaminazioni con eritrociti e fibroblasti così come la cultura primaria e affidabile verifica di origine melanoma delle cellule. Recenti studi hanno rivelato che i melanomi, come la maggior parte dei tumori, porto una piccola sottopopolazione di cellule staminali tumorali (CSC), che sembrano alimentare esclusivamente l&#39;iniziazione del tumore e la progressione verso lo stato metastatico. Uno degli indicatori chiave per l&#39;identificazione e l&#39;isolamento CSC nel melanoma è CD133. Per isolare CD133 + CSC da colture primarie di melanoma, abbiamo modificato e ottimizzato la magnetico selezione delle cellule attivate (MACS) procedura dal Miltenyi con conseguente elevata purezza smistamento e la vitalità delle CD133 + e CD133 CSC - massa, che può essere coltivato e funzionalmente analizzati successivamente.

Preparazione di singole cellule di tessuto tumorale La figura 2 esemplifica una metastasi linfa resecata nodo di un paziente prima fase tardiva melanoma (A) e dopo (B) meccanica dissociazione in 2-4 pezzi millimetri. Seguendo dissociazione enzimatica del tessuto e filtrazione attraverso una maglia di nylon 70 pm, cellule sono state pellettizzate e il supernatante scartato. In questa fase abbiamo osservato un&#39;elevata contaminazione con eritrociti come indicato dal colore ros...

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Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

In questo articolo si descrive la preparazione di tessuti melanoma appena ottenuto in colture cellulari primarie, e come rimuovere le contaminazioni di eritrociti e fibroblasti dalle cellule tumorali. Infine, si descrive come CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putative cellule staminali di melanoma sono ordinati dal CD133<sup&gt; -</sup&gt; Massa utilizzando activated cell sorting magnetico (MACS).

Paziente coltura cellulare derivato e isolamento di CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putativi staminali alle cellule tumorali di melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

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Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

21.1K Views.  Charité - Universitätsmedizin Berlin. In questo articolo si descrive la preparazione di tessuti melanoma appena ottenuto in colture cellulari primarie, e come rimuovere le contaminazioni di eritrociti e fibroblasti dalle cellule tumorali. Infine, si descrive come CD133 + Putative cellule staminali di melanoma sono ordinati dal CD133 - Massa utilizzando activated cell sorting magnetico (MACS).

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Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

Isolamento dei Nuclei Cardiomyocyte dal post-mortem del tessuto

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

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Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Differenziazione Isolamento, caratterizzazione e comparata delle cellule umane Dental Pulp staminali derivate da denti permanenti mediante due diversi metodi

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Time-lapse imaging di primaria preneoplastiche cellule epiteliali mammarie Derivato da modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Isolamento di cancro cellule staminali da campioni umani di cancro alla prostata

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

Arricchimento per chemioresistente Ovarian Cancer Stem Cells da linee cellulari umane

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Isolamento e Immortalizzazione di paziente derivati ​​da linee cellulari provenienti da Muscle Biopsia per la malattia Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Studiare cancro del pancreas staminali caratteristiche cellulari per lo sviluppo di nuove strategie di trattamento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Isolamento e cultura espansione delle cellule endoteliali tumore-specifici

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

Generazione di cancro alla prostata del paziente Derivato modelli di xenotrapianto di cellule tumorali circolanti

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

Isolamento e Cellular Fenotipizzazione di cellule staminali mesenchimali derivate dal liquido sinoviale e del midollo osseo di mini-pig

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...