Questo protocollo descrive il primo modello apical-out in-a-dish ed è un miglioramento critico rispetto ai modelli enteroidi basali laterali out-a-dish quando si stabilisce la modellazione in vitro di potenziali terapie destinate alla somministrazione orale. Questo metodo consente l'accesso alla superficie apicale degli enteroidi. I composti possono essere aggiunti ai terreni cellulari e i composti vengono assorbiti apicamente come sarebbero in vivo.
I ricercatori interessati a stabilire un sistema in vitro di infiammazione intestinale per testare potenziali terapie orali possono trovare questa tecnica particolarmente utile. I tessuti provenienti da età e specie diverse possono richiedere un'ulteriore standardizzazione. Quindi i pazienti mentre stabiliscono i tempi di inversione di polarità possono essere necessari.
Per invertire la polarità degli enteroidi 3D, aspirare i mezzi da ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti di enteroidi basolaterali 3D stabiliti. Aggiungere 500 microlitri di cinque millimolari ghiacciati, EDTA o PBS a ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e interrompere delicatamente meccanicamente l'estratto della membrana basale o la cupola della matrice extracellulare pipettando su e giù da cinque a sei volte con una pipetta P 200. Trasferire il contenuto di quattro pozzetti in un tubo cronico da 15 millilitri.
Quindi aggiungere otto millilitri di PBS EDTA ghiacciato al tubo. Trasferire i restanti 20 pozzi nello stesso modo. Incubare i tubi a quattro gradi Celsius per un'ora su una piattaforma rotante o agitatore a 330 RPM.
Dopo l'incubazione centrifugare le provette ed eliminare il surnatante da ciascuna provetta. Unire e lavare il pellet con cinque millilitri di DMEM F12. Quindi centrifugare la sospensione delle cellule e rimuovere il surnatante prima di aggiungere 12 millilitri di mezzo privo di antibiotici al tubo assicurandosi che i pellet cellulari siano risospesi.
Pippet 500 microlitri della sospensione enteroide in ciascun pozzetto di una piastra di attacco ultra-bassa a 24 pozzetti. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per due o cinque giorni o fino a quando gli enteroidi non hanno invertito la polarità. Il primo giorno di astensione, trasferire il contenuto di quattro pozzetti di una piastra da 24 pozzetti in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Ripetere l'operazione per tutti i pozzetti desiderati con ogni trattamento in un tubo separato. Centrifugare i tubi e risospendere il pellet in 300 microlitri di fissativo aldeidico al 4% a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti lavare il pellet con 500 microlitri di PBS.
Aggiungere 500 microlitri di 0,1% Triton X 100 ai tubi. Incubare i tubi per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, posizionare i tubi su un rotatore o agitatore a 200 RPM per 15 minuti da due a otto gradi Celsius.
Dopo l'ultima incubazione, aggiungere 500 microlitri di NDS al 10% in PBS T e incubare a temperatura ambiente per 45 minuti. Durante l'incubazione, preparare la soluzione anticorpale primaria. Il giorno successivo aggiungere da 250 a 500 microlitri di PBS T ai tubi a seconda delle dimensioni del pellet e posizionarli sul rotatore o sull'agitatore a 200 giri / min per un'ora da due a otto gradi Celsius.
Aggiungere 200 microlitri della soluzione anticorpale secondaria e incubare i tubi da due a otto gradi Celsius al buio. Il giorno successivo, procedere al montaggio di enteroidi apicali colorati ruotando i tubi e rimuovendo 100 microlitri di surnatante. Risospendere le cellule nei restanti 100 microlitri di surnatante e trasferire la sospensione cellulare in provette da 500 microlitri.
Centrifugare i tubi in una mini centrifuga per 20 secondi. Rimuovere il surnatante e risospendere i pellet in 100 microlitri di colorazione di acido nucleico rosso a temperatura ambiente. Dopo 20 minuti di incubazione, centrifugare le cellule e risospendere il pellet in 100 microlitri di PBS.
Dopo il secondo lavaggio e centrifugazione rimuovere 70 microlitri di surnatante e risospendere il pellet nel volume rimanente di PBS. Quindi trasferire la sospensione cellulare su un vetrino di copertura etichettato 24 per 60 millimetri. Applicare 75 microlitri di montante direttamente sul campione e rimuovere eventuali bolle con una punta di pipetta.
Dopo la polimerizzazione durante la notte al buio, applicare un sottile strato di glicerolo sui vetrini del coperchio, quindi montare le scivolate di copertura sul vetrino e premerlo delicatamente in posizione. Tocca per rimuovere eventuali bolle tra la vetrina e la diapositiva. Lasciare che il vetrino del coperchio si fissi a temperatura ambiente al buio per due ore prima di visualizzare gli enteroidi a 20 volte l'ingrandimento con un microscopio confocale.
Per i trattamenti enteroidi, stabilire un'enterocolite necrotizzante apicale in un modello piatto per 24 ore come descritto nel manoscritto testuale. Prima di eseguire il test, rimuovere 100 microlitri di mezzi da ciascun pozzetto lasciando i restanti 400 microlitri. Aggiungere 400 microlitri di reagente per il saggio di vitalità cellulare a ciascun pozzetto.
Mescolare vigorosamente il contenuto su uno shaker a piastre per cinque minuti a 200 RPM per indurre la lisi cellulare. Quindi, trasferire 200 microlitri in un singolo pozzetto di una piastra a fondo chiaro 96. Ripetere per i restanti 600 microlitri creando quattro repliche tecniche per pozzetto.
Utilizzando un lettore di piastre in grado di luminescenza, registrare i valori a 0,25 millisecondi di integrazione e confrontare i valori relativi tra i trattamenti. La colorazione rappresentativa dell'immunofluorescenza del controllo ha confermato la localizzazione apicale dei nuclei verso il lume e l'individuazione di cattivi sul bordo esterno dell'epitelio. Rispetto al controllo, l'esposizione al polisaccaride lipo, alla necrosi tumorale alfa o all'ipossia da sola non ha indotto cambiamenti evidenti nella morfologia delle cellule grossolane E-caderina o localizzazione del cattivo o intensità fluorescente.
Il trattamento con lipopolisaccaride o necrosi tumorale alfa in combinazione con ipossia ha interrotto l'architettura epiteliale e ha dimostrato una significativa perdita di aderenza della giunzione e dell'espressione proteica del bordo del pennello rivelata dalla perdita dell'udito ECA e dalla colorazione del cattivo. La vitalità delle cellule apicali è stata determinata in condizioni normossiche o ipossiche. In condizioni normossiche rispetto al controllo lipo polisaccaride o necrosi tumorale alfa non ha influenzato significativamente la vitalità cellulare degli enteroidi.
Tuttavia, riduzioni significative della vitalità sono state osservate nel polisaccaride lipo o necrosi tumorale alfa in combinazione con ipossia rispetto alla sola ipossia. Stabilendo un modello apicale in-a-dish. Ricordarsi di mantenere l'EDTA nella sospensione cellulare ghiacciata.
Ciò migliorerà l'inversione di polarità e assicurerà che tutta l'ECM sia correttamente liquefatta e rimossa. Altre applicazioni a valle come QPCR, RNA-seq, western blotting o valutazioni funzionali della permeabilità della barriera possono essere eseguite ulteriormente per caratterizzare la risposta alla segnalazione infiammatoria nell'ipossia.
