Questo protocollo mostra come utilizzare organoidi intestinali derivati dalla biopsia e la tecnologia organ-on-a-chip per generare un chip intestinale fisiologicamente rilevante che può quindi essere utilizzato per prevedere la farmacocinetica e l'interazione farmaco-farmaco e per studiare la disfunzione della barriera epiteliale intestinale. L'unione degli organoidi nella tecnologia organ-on-a-chip ci consente di riprodurre la complessità dell'epitelio intestinale. Inoltre, consente un maggiore controllo sperimentale dei segnali meccanici, della distribuzione del flusso e dei gradienti biochimici.
Questo metodo emula la complessa fisiologia dell'intestino umano, dando una maggiore comprensione delle basi cellulari e molecolari delle funzioni intestinali normali e patologiche. Questo aiuta a prevedere meglio la farmacocinetica e la farmacodinamica e i potenziali farmaci candidati per prevenire il danno infiammatorio. La semina è un passaggio fondamentale nel protocollo.
Un'eccessiva frammentazione o un'imprecisa densità di semina dei frammenti organoidi intestinali possono compromettere lo sviluppo e la differenziazione della barriera epiteliale. Per iniziare, aspirare il mezzo dalla coltura organoide statica. Recuperare i media da un numero sufficiente di pozzi per raggiungere una densità di semina finale di otto milioni di cellule per millilitro.
Aggiungere 500 microlitri di soluzione di dissociazione BMM ghiacciata a ciascun pozzetto e attaccare il BMM solubilizzato dalla superficie del pozzo. Raccogliere la sospensione in un tubo legante a basso contenuto proteico da 15 millilitri e posizionarlo sul ghiaccio. Agitare delicatamente il tubo ogni 15 minuti per un'ora.
Centrifugare a 300 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius per ottenere un pellet organoide. Se si osserva uno strato di gel trasparente sopra il pellet, aspirare la soluzione dal tubo. Risospendere il pellet e aggiungere un volume uguale di soluzione di dissociazione BMM.
Incubare su ghiaccio per 10 minuti e centrifugare. Ripetere fino a quando non sono presenti residui di BMM solubilizzati. Quindi scartare il surnatante e risospendere il pellet in due millilitri di soluzione di digestione organoide.
Incubare il tubo a 37 gradi Celsius per uno o tre minuti e aggiungere otto millilitri di DMEM F12 avanzato per fermare la reazione enzimatica. Centrifugare e risospendere il pellet in mezzo di crescita organoide completo per ottenere otto milioni di cellule per millilitro. Aliquote 360 microlitri in provette sterili da 1,5 millilitri a basso legame proteico.
Quindi, rimuovere il mezzo dal canale superiore dei trucioli rivestiti e aggiungere 30 microlitri della sospensione cellulare. Incubare i trucioli a 37 gradi Celsius durante la notte per far aderire i frammenti organoidi alla membrana. Aggiungere tre millilitri di mezzo di crescita organoide completo pre-equilibrato al serbatoio di ingresso superiore e tre millilitri di mezzo di crescita delle cellule endoteliali pre-equilibrato nel serbatoio di ingresso inferiore.
Aggiungere 300 microlitri dello stesso fluido nei rispettivi serbatoi di uscita superiore e inferiore. Trasferire il vassoio che trasporta i moduli portatili nel modulo coltura. Sul modulo coltura, eseguire ripetutamente il ciclo primo fino a quando non si formano goccioline sufficienti per collegare correttamente i chip.
Quindi far scorrere il portachip nel modulo portatile. Quindi avviare il ciclo di regolazione di due ore per pressurizzare i terreni di coltura nel modulo portatile e nel chip, dopodiché riprenderanno le condizioni programmate. Quindi, modifica le impostazioni di allungamento e avvia il modulo cultura.
Dopo 24 ore, ripetere il ciclo con 10% di allungamento e la stessa frequenza. Per preparare il mezzo di dosaggio o il controllo del veicolo, diluire le soluzioni stock di induttori CYP o DMSO in un mezzo di crescita organoide completo e in un terreno di crescita delle cellule endoteliali. Mettere in pausa il modulo di coltura e portare i vassoi nell'armadio di biosicurezza.
Sostituire il fluido in tutti i serbatoi di ingresso e uscita con due millilitri di fluido dosatore con induttori o controllo del veicolo. Riportare i moduli portatili al modulo di coltura e riavviare il flusso a 30 microlitri all'ora. Sostituire il terreno con una soluzione inducente appena preparata ogni 24 ore e continuare la coltura per 48-72 ore.
Quindi portare i vassoi nell'armadio di biosicurezza e aspirare il mezzo di dosaggio da tutti i serbatoi. Lavare e sostituire il serbatoio di ingresso superiore con mezzo DMEM F12 avanzato caldo e il serbatoio inferiore con mezzo di crescita delle cellule endoteliali. Sostituire il mezzo di lavaggio con un millilitro di soluzione di substrato della sonda.
Perfondere i trucioli ad una portata elevata di 1.000 microlitri all'ora per cinque minuti e aspirare i serbatoi di uscita superiore e inferiore. Riportare i chip nel modulo di coltura e incubare per un'ora sotto un flusso costante di 300 microlitri all'ora. Dopo un'ora di trattamento, interrompere il flusso e portare i vassoi nell'armadio di biosicurezza.
Raccogliere 100 microlitri di effluente dal serbatoio di uscita superiore e aggiungerlo a un tubo contenente 200 microlitri di soluzione di arresto. Posizionare immediatamente le provette su ghiaccio secco e conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius. Lavare entrambi i canali con 200 microlitri di DPBS sterile.
Quindi bloccare l'uscita del canale inferiore con una punta della pipetta filtrante da 200 microlitri. Perfondere 50 microlitri della soluzione di dissociazione attraverso il canale inferiore e incubare per due minuti a temperatura ambiente. Assicurare il completo distacco delle cellule endoteliali e rimuovere la soluzione di dissociazione dal canale mediante pipettaggio.
Ripetere il lavaggio. Quindi, bloccare l'uscita del canale superiore e perfondere 75 microlitri di tampone di lisi proteica. Lasciare inserire la punta della pipetta e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.
Raccogliere i lisati cellulari in un tubo da 1,5 millilitri pipettando da cinque a 10 volte. Ripetere la perfusione e la raccolta per ottenere il completo distacco delle cellule e conservare i lisati a meno 80 gradi Celsius fino all'analisi. Per la lisi dell'RNA, seguire la stessa procedura utilizzando 150 microlitri di tampone di lisi dell'RNA.
In primo luogo, preparare una soluzione di dosaggio gamma di interferone diluendo le soluzioni madre nel mezzo di crescita delle cellule endoteliali degassate. Nell'armadio di biosicurezza, rimuovere il mezzo dai serbatoi di ingresso del canale inferiore e sostituirlo con tre millilitri di soluzione di dosaggio al giorno. Quindi posizionare i vassoi nel modulo di coltura e perfondere i chip ad una portata elevata di 1.000 microlitri all'ora per cinque minuti.
Passare la portata a 60 microlitri all'ora e continuare la coltura fluidica. Aggiungere 100 microlitri di DPBS per pozzetto in una piastra a parete nera a 96 pozzetti. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 50 microlitri dell'effluente da tutti i serbatoi ai rispettivi pozzi.
Per preparare una curva standard, eseguire una diluizione tripla del mezzo contenente 100 microgrammi per millilitro di tre kilodalton dextran cascade blue in DPBS. Quindi eseguire deliri seriali utilizzando una diluizione triplice del mezzo di crescita delle cellule endoteliali in DPBS. Caratteristiche morfologiche distinte dei frammenti del duodeno e del colon sono state evidenziate dalla presenza delle formazioni simili a villi nel chip di duodeno che rappresentano l'architettura dell'intestino tenue.
Nel chip di duodeno esposto agli induttori del citocromo P450 rifampicina e vitamina D3, c'era un'elevata espressione genica di mRNA per l'enzima metabolizzante del farmaco citocromo P450 3A4 e una maggiore attività catalitica dell'enzima citocromo P450, indicando risposte di induzione appropriate in tutti e tre i donatori di organoidi. Dopo aver trattato il monostrato epiteliale del chip del colon con interferone gamma, sono stati osservati una compromissione della morfologia cellulare e la perdita dell'epitelio colonnare. Inoltre, il trattamento con interferone gamma ha portato ad un aumento del segnale citoplasmatico delle proteine di giunzione strette e aderenti rispetto al controllo del veicolo, mostrando lo spostamento dei marcatori di giunzione stretti ZO-1 e claudina 4 e l'internalizzazione dell'occludina e della E-caderina.
Un aumento significativo della permeabilità paracellulare epiteliale è stato osservato dopo 48 ore di stimolazione dell'interferone gamma sui chip del colon. Allo stesso modo, l'interferone gamma induce l'attivazione dell'apoptosi indicata dall'aumento del contenuto intracellulare della caspasi 3 scissa. L'interferone gamma ha indotto una secrezione polarizzata di molecole pro-infiammatorie nel chip del colon, come dimostrato dalla secrezione basolaterale di VCAM-1 e interleuchina-6 e dalla secrezione apicale di ICAM-1 e proteina amiloide sierica A. Per una coltura di chip intestinali di successo, si dovrebbero utilizzare organoidi indifferenziati e seguire le istruzioni di frammentazione e densità di semina.
Dopo aver stabilito con successo il chip intestinale, possiamo studiare l'assorbimento, il trasporto e il metabolismo intestinale, i livelli di nutrienti e la secrezione ormonale intestinale, le interazioni dei patogeni del microbico ospite, la sicurezza e l'efficacia dei farmaci, i meccanismi della malattia specifici del paziente e le risposte alle terapie.
