Con l'obiettivo di studiare l'integrità della barriera intestinale, abbiamo sviluppato un metodo per misurare l'integrità della barriera intestinale nei piccoli organoidi intestinali del topo. Al contrario, ci riferiamo alla coltura cellulare monostrato usata, il nostro saggio si basa su piccoli organoidi intestinali tridimensionali. Adattare un saggio bidimensionale al nostro modello è stato essenziale per la sua praticità.
Il saggio si basa su organoidi coltivati in vitro e la sua applicazione aiuterà a definire induttori e inibitori dell'integrità della barriera intestinale. La regolazione delle proteine della giunzione stretta è una caratteristica importante di tutte le cellule epiteliali. Il nostro saggio consente la funzione e l'analisi dell'integrità della barriera epiteliale.
Per misurare l'integrità barriera degli organoidi isolati dal tessuto intestinale del topo, prima precoat tutti i tubi di centrifugazione che verranno utilizzati per conservare gli organoidi durante il processo di placcatura con abbastanza 0,1%BSA in PBS per coprire tutte le superfici plastiche. Rimuovere immediatamente la soluzione BSA e posizionare i tubi sul ghiaccio. Successivamente, scongelare la soluzione a matrice cellulare e il mezzo di coltura organoide sul ghiaccio e rimuovere con cura il mezzo di coltura da ogni pozzo di una piastra di coltura organoide a 48 porsi.
Lavare ogni bene con un millilitro di PBS freddo prima di pipettare vigorosamente per sciogliere le matrici cellulari. Quando sono state ottenute sospensioni cellulari relativamente omogenee, lavare gli organoidi con PBS fresco due volte per centrifugazione e rimorsi di ogni coltura organoide in 40 microlitri di mezzo freddo. Dissociare le grandi strutture organoidi attraverso una punta di pipetta da 10 microlitri cinque volte per raccogliere strutture di dimensioni da 40 a 60 micrometri e mescolare ogni sospensione organoide con 40 microlitri di soluzione a matrice cellulare appena preparata.
Aggiungere ogni sospensione della soluzione a matrice di cellule organoidi al centro dei singoli pozzi di un copriscivolo a otto porsi e posizionare lo scivolo su un icepack per cinque minuti. Al termine dell'incubazione, posizionare lo scivolo a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 20 minuti per consentire la polimerizzazione della struttura della matrice della cella organoide prima di aggiungere 150 microlitri di mezzo di coltura organoide ad ogni pozzo per un'incubazione di 24 ore nell'incubatore di coltura cellulare. Alla fine dell'incubazione, trattare i pozzi di controllo positivi con 10 nanogrammi per millilitro di gamma di interferone murino ricombinante per 48 ore.
Per eseguire un saggio di permeabilità, trasferire il coverslip a camera alla camera di incubazione riscaldata di 37 gradi Celsius di un microscopio confocale invertito e impostare l'anidride carbonica della camera al 5%Blocca saldamente il coperchio sullo stadio del microscopio e regola le impostazioni di imaging del microscopio per visualizzare gli organoidi in un pozzo della camera. Quindi, aggiungere tre microlitri di lucifero giallo lucifero appena preparato da 100 millimolare in 150 microlitri di pozzo medio-uno per un'ora di incubazione nella camera del microscopio. Al termine dell'incubazione, regolare la messa a fuoco per visualizzare il lume dell'organoide di riferimento e definire l'energia laser richiesta per l'eccitazione gialla lucifero e la rispettiva sensibilità di rilevamento dello strumento per visualizzare il segnale giallo Lucifero al 30-40% della gamma dinamica disponibile dello strumento.
In alternativa, l'intensità del segnale può essere modificata modificando il tempo di esposizione. Per trovare le posizioni di circa 10 organoidi con una struttura sferica vicino alla superficie del coverslip per pozzo con interferenze differenziali contrastano l'imaging dal vivo, catturando organoidi con diametri comparabili e concentrandosi sulla fetta centrale degli organoidi per immaginare i lumen. Registrare il contrasto di interferenza differenziale e la fluorescenza gialla Lucifero di ogni posizione per documentare la forma e l'autofluorescenza di ogni organoide.
Una volta che tutti gli organoidi sono stati immagine, aggiungere 150 microlitri di mezzo, incluso il giallo Lucifero, ai pozzi di trattamento giallo Lucifero e l'immagine di tutti i pozzi ogni cinque minuti per 70 minuti. Al termine della sessione di imaging, aggiungere quattro microlitri di EGTA appena preparati a 100 microlitri di mezzo. Aggiungere l'EGTA diluito ai pozzi appropriati.
Quindi, registrare la fluorescenza degli organoidi in ogni pozzo ogni cinque minuti per 30 minuti. Assicurati di praticare la manipolazione e la coltura o gli organoidi in anticipo poiché la vitalità e l'integrità cellulare sono un prerequisito per il successo del saggio. In questo esperimento rappresentativo, dopo 70 minuti di trattamento con lucifero giallo intraluminale Lucifero la fluorescenza gialla era visibile solo negli organoidi di animali di tipo selvatico trattati con gamma di interferone.
Né i controlli non stimolati, né gli organoidi derivati dal recettore gamma dell'interferone-2 animali knockout hanno mostrato fluorescenza gialla lucifero intraluminale alla fine del periodo di trattamento. L'aggiunta di EGTA ha causato una rottura aspecifica dell'integrità della barriera intestinale sequestrando co-fattori di giunzione stretti, con conseguente assorbimento e espressione del giallo Lucifero in tutti gli organoidi indipendentemente dall'origine o dalle condizioni di trattamento. Possono essere quantificati anche i valori di intensità relativa per il livello di fluorescenza gialla di Lucifero all'interno del lume organoide e al di fuori di ogni organoide.
Assicurarsi di selezionare organoidi con una dimensione comparabile intorno alla configurazione e di selezionare l'asse impostato in modo da poter immaginare il lume centrale dell'organoide. Oltre a utilizzare sostanze che inducono la rottura della barriera intestinale, possiamo anche studiare strategie per l'inibizione della distruzione della barriera intestinale. Poiché questa metodologia si basa su cellule primarie di un singolo animale, può essere utilizzata per molti saggi, riducendo il numero di animali necessari per ogni esperimento.
