Il processo di induzione dalle hPSC alle cellule retiniche è complicato e richiede molto tempo. Questo protocollo ottimizzato può generare tessuti retinici con elevata riproducibilità e nessun costo. Il vantaggio di questo protocollo è la quantificazione della dimensione EB e della densità di placcatura per migliorare significativamente l'efficienza e la ripetibilità dell'induzione retinica da hPSC.
Con questo metodo, tutte le principali cellule retiniche appaiono sequenzialmente e ricapitolano le fasi principali dello sviluppo retinico. Faciliterà la modellazione delle malattie e la terapia cellulare per le malattie degenerative della retina. Dimostrando la procedura, siamo con Yuanyuan Guan, uno studente di dottorato, e Bingbing Xie, un tecnico del laboratorio.
Iniziare preparando 50 mL di soluzione ECM aggiungendo 1 mL della terza soluzione stock 50 volte a 50 mL di DMEM. Quindi, aggiungere 1 mL di questa soluzione ECM preparata a ciascun pozzetti di una piastra a sei pozzetti e incubarla per un'ora a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Preparare il mezzo di manutenzione hPSC secondo le istruzioni del produttore e preriscaldarlo a temperatura ambiente per 30 minuti.
Versare una fiala criogenica di hPSC da un serbatoio di azoto liquido incubandola a bagnomaria a 37 gradi Celsius per 30 secondi. Disinfettarlo con cura con uno spray alcolico al 75% e metterlo in un armadietto di bio-sicurezza. Trasferire la sospensione cellulare dal flaconcino a un tubo da 15 millimetri.
Quindi, aggiungere 5 mL di mezzo di manutenzione preriscaldato goccia a goccia al tubo usando una pipetta da 5 ml, scuotendo delicatamente il tubo per miscelare gli IPPC. Centrifugare il tubo a 170 volte G per cinque minuti. Rimuovere con attenzione la maggior parte del surnatante utilizzando una pipetta da 1 mL, lasciando circa 50 microlitri di surnatante per evitare di perdere le cellule.
Sospendere di ricaspendere il pellet con 1 mL di mezzo di manutenzione mediante pipettaggio su e giù. Rimuovere l'ECM dai pozzi preverniciati e aggiungere 1,5 millilitri di terreno di manutenzione a ciascun pozzo. Quindi distribuire 0,5 millilitri di sospensione cellulare in ciascun pozzo.
Agitare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente le hPSC. Metti la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per almeno 24 ore per promuovere l'aderenza cellulare. Cambia mezzo ogni giorno e passa hPSC all'80% di confluenza.
Il giorno-0, iniziare la differenziazione rimuovendo le cellule di confluenza dell'80% da un pozzo della piastra a sei pozzi. Raccogliere le cellule con la soluzione di dissociazione EDTA come descritto nel manoscritto di testo. Rimuovere la soluzione di EDTA e aggiungere 1 mL di mezzo di mantenimento contenente 10 fluvastatina micromolare per arrestare la dissociazione cellulare.
Raccogliere le celle con una pipetta da 1 mL. Trasferire la sospensione cellulare in una capsula di Petri da 100 millimetri ultra-bassa e aggiungere 9 ml di mezzo di manutenzione contenente 10 fluvastatina micromolare alla piastra. Agitare delicatamente il piatto due volte per distribuire uniformemente le cellule.
Quindi, mettilo nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo che le cellule sono state coltivate per almeno 24 ore, osservarle al microscopio. Aggiungere 9 mL di mezzo di manutenzione e 3 mL di NIM a un tubo da 15 mL.
Trasferire le colture cellulari in un tubo di centrifuga da 15 mL e aggiungere 10 mL della miscela NIM preriscaldata al piatto. Centrifugare il tubo a 60 volte G per 3 minuti per raccogliere gli aggregati. Quindi rimuovere il surnatante usando una pipetta da 5 ml, lasciando circa 500 microlitri per evitare di perdere le cellule.
Aggiungere 2 ml di miscela al tubo e trasferire nuovamente la sospensione nella stessa capsula di Petri. Agitare delicatamente il piatto per distribuire uniformemente gli aggregati cellulari. Quindi, rimettete il piatto nell'incubatrice.
Il giorno 5, rimuovere l'ECM dai piatti pre-rivestiti e aggiungere 10 ml di NIM preriscaldato a ciascun piatto. Eserite il piatto contenente Ebs e controllate la qualità degli EB al microscopio, assicurandovi che siano luminosi e rotondi. Raccogliere tutti gli EB in un tubo da 15 ml e lasciarli depositare per 5 minuti.
Quindi, rimuovere la maggior parte del surnatante, lasciando circa 2 ml di mezzo. Dopo aver contato gli EB, seminarli goccia a goccia ad una densità di circa 2-3 EB per centimetro quadrato in piatti rivestiti contenenti 10 ml di NIM. Agitare delicatamente i piatti per distribuire uniformemente gli EB e metterli nell'incubatrice per almeno 24 ore.
Utilizzare un ago di tungsteno o un ago con una siringa da 1 mL per staccare meccanicamente le vescicole ottiche morfologicamente identificabili, insieme all'epitelio pigmentato retinico adiacente nei giorni da 28 a 35. Coltivateli in sospensione. Mettere 50-60 vescicole ottiche in ogni piatto di coltura ad attacco basso 100 millimetri, contenente 15 ml di RDM per la formazione di organoidi retinici.
Cambia il mezzo ogni 2 o 3 giorni fino al giorno-42. Per avviare la differenziazione retinica, le hPSC sono state dissociate in piccoli grumi e coltivate in sospensione, che hanno formato EB dal Giorno-1. Il giorno 5 gli EB sono stati placcati sui piatti di coltura rivestiti di ECM e le cellule sono gradualmente migrate fuori dagli EB.
Il giorno 16, il mezzo di induzione è stato sostituito da RDM, causando la formazione dei domini della retina neurale e gradualmente sporgenti dal piatto, così come la formazione di strutture vescicolari ottiche circondate da cellule RPE. Durante i giorni da 28 a 35, organoidi retinici costituiti dalla retina neurale, attaccati a una sfera RPE. Da un lato, si sono formate le cellule.
Con il progredire della differenziazione e della specificazione retinica, le hPSC producevano sottotipi di retina neurale che gradualmente si allineavano in strati, imitando le caratteristiche architettoniche di una retina umana nativa. Le cellule gangliari retiniche sono state inizialmente generate da progenitori retinici e accumulate nel lato basale della neuro retina. Con questo protocollo, gli organoidi retinici si sono sviluppati in fotorecettori altamente maturi con entrambi, bastoncelli ricchi e coni.
Le cellule fotorecettrici si trovavano nel lato apicale, mentre le cellule amacrine, le cellule orizzontali, le cellule bipolari e le cellule gliali muller erano tutte situate nello strato intermedio della retina neurale. I punti chiave di questo protocollo sono la creazione di Ebs di alta qualità e la loro semina alla giusta densità.
