Questo protocollo descrive un metodo semplice ed efficiente per differenziare gli IPC umani in complessi organoidi neuroretinici tridimensionali per la ricerca e le applicazioni rigenerative. Questa tecnica coinvolge sia colture aderenti che in sospensione, che consentono il prelievo selettivo e l'arricchimento sia degli organoidi retinici che delle cellule RP. Può offrire una fornitura praticabile e regolare di fonti cellulari per lo sviluppo di terapie cellulari per le malattie degenerative della retina.
Tali organoidi retinici derivati da cellule staminali e cellule RPE sono utili come modelli in vitro per studiare lo sviluppo oculare e le malattie retiniche ereditarie. Questo metodo può essere facilmente replicato da laboratori di ricerca che hanno già familiarità con la gestione di colture IPSC umane. La dimostrazione visiva supporta notevolmente l'identificazione dei campi oculari e l'isolamento delle coppe neuroretiniche in base al loro posizionamento spaziale e alle loro caratteristiche morfologiche.
Per iniziare, aspirare il mezzo esaurito dal 70 all'80% di colture IPSC umane confluenti in piastre a sei pozzetti. Aggiungere PBS ai pozzetti, ruotarli e aspirare il tampone di lavaggio. Quindi aggiungere un millilitro di soluzione di dissociazione cellulare o CDS a ciascun pozzetto e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per cinque-sette minuti fino a quando le cellule non si arrotondano.
Aspirare il CDS e raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Girare il tubo a 1.000 giri / min per quattro minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1,2 millilitri di terreno Essential 8.
Erogare 200 microlitri della sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti rivestita di matrice contenente 1,5 millilitri di terreno di coltura IPSC e 10 micromolari Y27632. Dopo 12-24 ore, rimuovere il mezzo esaurito e aggiungere il mezzo di ascensione completo preriscaldato senza Y27632 per mantenere le colture. Cambiare il terreno di coltura ogni 24 ore fino a quando le colture raggiungono il 70-80% di confluenza.
Il giorno zero, aspirare il mezzo di mantenimento IPSC umano e aggiungere il mezzo di induzione della differenziazione contenente un nanogrammo per millilitro di BFGF e un nanogrammo per millilitro di Noggin alla piastra a sei pozzetti. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al 5%. Il primo giorno, aspirare il mezzo esaurito e aggiungere il mezzo di induzione di differenziazione contenente un nanogrammo per millilitro di BFGF e 10 nanogrammi per millilitro di Noggin.
Incubare nuovamente le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al 5%. Il secondo e il terzo giorno, rimuovere il mezzo esaurito e aggiungere il mezzo di induzione di differenziazione contenente 10 nanogrammi per millilitro di Noggin. Dopo aver aggiunto due millilitri per pozzetto medio a una piastra a sei pozzetti, incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al 5% e cambiare il mezzo ogni 24 ore.
Il quarto giorno, rimuovere il mezzo esaurito e aggiungere il mezzo di differenziazione retinica o RDM. Seguire la stessa procedura per aggiungere due millilitri per pozzetto medio a una piastra a sei pozzetti e per incubare le colture. Cambia il mezzo ogni giorno.
Intorno ai giorni 14 e 18, osservare le colture al microscopio con un ingrandimento 10X per l'emergere di domini neurali simili a rosette costituiti da progenitori del campo oculare precoce. Intorno ai giorni 21 e 28, osservare le colture al microscopio con ingrandimento 4X e 10X per osservare l'emergere di EFP distinte auto-organizzate con un'isola centrale di strutture neuroretiniche 3D circolari circondate da escrescenze contigue di epitelio neuro ed epitelio superficiale oculare. Prendi una pipetta Pasteur sterile e tieni la base in una mano e la punta capillare nell'altra.
Fiamma sterilizzare e riscaldare la regione vicino al centro della punta capillare con movimenti rotazionali fino a quando il vetro diventa flessibile. Quindi allontanarsi dalla fiamma e tirare rapidamente la punta del capillare verso l'esterno per creare una punta capillare fine con un lume chiuso. Tenere la punta sottile orizzontalmente davanti alla fiamma e passarla rapidamente attraverso la fiamma con un movimento verso l'esterno per creare un gancio liscio o una punta capillare a forma di L.
Sotto uno stereomicroscopio, prelevare manualmente le coppe neuroretiniche ben formate dalle singole EFP utilizzando la zona di curvatura esterna liscia del gancio capillare come misurino fine. Ai giorni 25 e 30, aggiungere quattro millilitri di mezzo di differenziazione retinica preriscaldato in un piatto da 60 millimetri a basso attacco alla coltura e mantenere le coppe retiniche per generare organoidi retinici 3D. Questo dovrebbe essere fatto prima di raccogliere le coppette neuro retiniche.
Impostare una micropipetta da un millimetro per aspirare 100 microlitri e utilizzare micro punte da un millilitro con ampie aperture per aspirare e trasferire le coppe retiniche galleggianti nei piatti di coltura freschi a bassa aderenza preparati in precedenza. Mantenere le coppe retiniche in RDM come colture di sospensione non aderenti e incubarle a 37 gradi Celsius in un incubatore ad anidride carbonica al 5%. Nei giorni 30 e 45, seguendo un metodo di alimentazione parziale, rimuovere metà del volume del mezzo esaurito e sostituirlo con un volume uguale di mezzo fresco.
Nei giorni 45 e 60, coltura degli organoidi retinici per altre due settimane in RDM contenente 100 taurina micromolare per supportare una migliore sopravvivenza e differenziazione del lignaggio dei progenitori neuroretinici e lo sviluppo di tipi di cellule retiniche mature. Gli organoidi retinici sono caratterizzati in diversi stadi di maturazione per l'espressione di diversi marcatori progenitori retinici utilizzando RT-PCR e immunoistochimica. I risultati della RT-PCR hanno confermato l'induzione e l'espressione di marcatori neuroretinici in organoidi retinici di un mese e organoidi retinici di due mesi.
Le immagini confocali di sezioni immuno-marcate di organoidi retinici immaturi che utilizzano anticorpi contro i marcatori progenitori neuro retinici Chx10, PAX6 e Otx2 e organoidi retinici maturi che utilizzano anticorpi contro i marcatori precursori dei fotorecettori recoverin e CRX sono mostrati qui. Lo strato più esterno marcato degli organoidi retinici con cellule fotorecettrici differenzianti viene ingrandito e mostrato in queste immagini. Le rudimentali estensioni interne simili a segmenti sono contrassegnate da frecce bianche.
I cluster EFP con la coppa neuroretinica al centro e le escrescenze RPE in migrazione mostrano pigmentazione lungo i bordi anteriori. Qui sono mostrate escrescenze epiteliali pigmentate ben differenziate da più EFP in tutta l'isola neuroretinica. Un maggiore ingrandimento di un EFP mostra la zona migratoria dei progenitori RPE e dell'epitelio della superficie oculare che circonda una coppa neuro retinica.
Qui sono mostrate colture aderenti estese che hanno sviluppato monostrati di cellule RPE immature contenenti cellule pigmentate e non pigmentate. Le colture monostrato di cellule RPE completamente mature e pigmentate mostrano la morfologia del ciottolo al giorno 60. Le celle RPE che esprimono PAX6, MITF e RPE65 sono mostrate in questa figura.
Queste immagini rappresentano EFP con aggregati anomali di progenitori retinici con laminazione distorta e mancanza di striature. EFP con la coppa neuroretinica in miniatura, ma priva della zona circostante di RPE e dell'epitelio della superficie oculare sono mostrati in questa figura. L'immagine rappresentativa mostra aggregati neuroretinici irregolari formati nella coltura della sospensione.
È molto importante iniziare il processo di differenziazione utilizzando colture di IPC in crescita quasi confluenti per ottenere un'induzione efficiente dei campi oculari entro tre o quattro settimane. Gli organoidi retinici e le cellule RPE generate da IPC normali e specifiche del paziente possono essere utilizzati come modelli di malattie retiniche e per testare nuovi farmaci terapeutici.
