I saccharibatteri sono parassiti obbligati che richiedono co-coltura con batteri ospiti appropriati. Poiché i saccaribatteri orali umani possono essere facilmente isolati per la maggior parte degli individui che utilizzano specie batteriche ospiti conosciute. Questo protocollo consentirà a qualsiasi ricercatore o laboratorio di isolare i propri ceppi nella co-coltura binaria.
Questa tecnica utilizza semplici dispositivi e attrezzature presenti nella maggior parte dei laboratori microbiologici ed è stata utilizzata con successo per coltura di oltre 30 isolati che rappresentano sei specie di saccharibacteri. Questo protocollo può essere utile per l'isolamento di altre specie di radiazioni seguite dal candidato, nonché di saccaribatteri provenienti da ambienti diversi e altri mammiferi, se è possibile identificare e isolare adeguati ospiti anobatterici. A dimostrare la procedura sarà Andrew Collins, un ex post-dottorato nel mio laboratorio.
Per iniziare, inizia colture di batteri ospiti come l'arachnia propionica, con abbastanza tempo per crescere fino alla fase stazionaria precoce. Per iniziare la coltura, inoculare da due a cinque millilitri di brodo di soia triptico contenente lo 0,1% di estratto di lievito con arachnia propionica e incubarlo a 37 gradi Celsius per 24 ore. Quindi, assemblare i supporti filtranti con membrane filtranti da 0,2 micrometri incise.
Avvolgerli in un foglio e sterilizzare con autoclave, insieme a tubi di centrifuga e gruppi di tappi. Sterilizzare forniture extra in caso di contatto accidentale con superfici non sterili. Raccogliere la placca dentale raschiando lungo la linea gengivale, utilizzando un punto di carta sterile, una curetta aggraziata o uno stuzzicadenti sterile o una punta di pipetta e trasferirla in un tampone adatto come MRD o PBS.
Tenere il campione sul ghiaccio fino a quando non è pronto a procedere ulteriormente. Rimescolare vigorosamente la placca dentale utilizzando una combinazione di vortici e pipettaggio con una piccola punta di pipetta, quindi aggiungere il campione di placca rimorsio su un tubo contenente nove millilitri di tampone MRD. Scartare con cura un gruppo filtrante sterile con tecnica aseptica.
Srotoilare un quarto di giro e stringere di nuovo il supporto del filtro per assicurarsi che i fili siano correttamente innesati e che l'apparecchio sia correttamente chiuso. Lavare la membrana passando 10 millilitri di tampone MRD attraverso l'apparecchio, usando una siringa. Per applicare il campione al filtro lavato, rimuovere lo stantuffo da una siringa e attaccarlo all'apparato filtrante.
Posizionare un tubo di centrifuga sterile sotto quell'apparato filtrante per catturare il filtrato, quindi versare il campione dentale disperso nella siringa e caricarlo sul filtro. Quindi applicare una leggera pressione sul pistone per spingere il campione attraverso il filtro. Lavare la membrana con altri 10 millilitri di tampone MRD e raccogliere il flusso attraverso lo stesso tubo del campione filtrato.
Quindi capovolgi il tubo a livello asettico e tieni il ghiaccio. Fare un segno di orientamento sul tubo e sul cappuccio per identificare la posizione del pellet di cella dopo la centrifugazione. Posizionare il tubo in una centrifuga ad alta velocità con il segno sul lato superiore e centrifugare i campioni a 60.000 G per un'ora a quattro gradi Celsius.
Dopo la centrifugazione, versare con cura il supernatante, mantenendo il pellet sul lato superiore del tubo. Quindi rimescolare il pellet in uno o due millilitri di tampone MRD con un vortice vigoroso. Preparare tubi di coltura aliquotando due millilitri di mezzi di crescita appropriati nei tubi.
Aggiungere quindi 200 microlitri di coltura notturna di organismi ospiti e da 100 a 200 microlitri di campione filtrato rimorsinato a ciascun tubo. Incubare i campioni combinati in condizioni appropriate per l'organismo ospite. Passare le cellule ogni due o tre giorni trasferendo 200 microlitri della coltura binaria a due millilitri di mezzo di crescita fresco in un nuovo tubo.
Se le colture passaggio non mostrano alcuna crescita a 200 microlitri di coltura ospite non infetta, quando si passa le cellule, restituire tubi inoculati all'incubatore. I microlitri Aliquote 24 del master PCR si mescolano in un tubo PCR da 0,2 millilitri. In un microlitro di coltura infetta da saccharibacteria, posizionare il tubo in un ciclore Thermo.
Impostare il programma PCR come descritto nel manoscritto di testo. Caricare ed eseguire i prodotti PCR su un gel Agros dell'1%. Una banda di circa 600 basi confermerà la presenza di saccharibacteria.
Per confermare la purezza delle colture positive, eseguire una diluizione seriale di 10 volte della cocoltura di saccharibacteri in un tampone sterile e distribuire 100 microlitri su una piastra di agar. Incubare la coltura in condizioni di crescita appropriate e osservare gli organismi contaminanti. Una banda di circa 600 basi confermerà la presenza di saccharibacteria.
Il rilevamento della PCR può apparire negativo nelle colture di infezione iniziale a causa di un basso numero di simbionti saccharibacteria. Tuttavia, dopo alcuni passaggi, dovrebbe apparire un forte prodotto PCR, che indica che si è verificata un'infezione stabile. Testare diverse specie ospiti con lo stesso filtrato saccharibacteria di solito avrà un basso tasso di successo.
Poiché l'interazione dell'host simbionte è molto specifica. Man mano che le culture infette crescono, dovrebbe apparire una normale crescita torbida. Man mano che la simbiosi si stabilisce, le colture infette appariranno meno torbidi delle colture di organismi ospiti non infetti.
Una coltura contaminata può essere purificata raccogliendo colonie infette dopo la placcatura. Le colonie infette possono talvolta essere identificate da una forma irregolare di colonia rispetto alle colonie non infette. La proporzione di colonie regolari dipende dal formicolio dei saccharibatteri nella coltura binaria.
Se il formicolio è basso, meno colonie appariranno irregolari, rendendo facile scegliere le colonie infette e iniziare una pura cultura binaria. Le culture potrebbero non apparire positive per diversi passaggi. Quindi saranno necessari alcuni pazienti.
È anche necessario controllare regolarmente la contaminazione delle colture binarie, in quanto ciò può destabilizzare la cultura e portare alla morte dei saccharibacteria. La coltura binaria può essere utilizzata per tutti i tipi di esperimenti di laboratorio. DNA e RNA possono essere estratti rispettivamente per il sequenziamento del genoma e l'analisi del trascrittame.
La patogenicità può anche essere studiata utilizzando modelli animali.
