Visualizzare l'assorbimento di piccole vescicole extracellulari, note anche come sEV, da parte di diverse cellule del midollo spinale, può confermare una consegna di successo di sEV. Ciò consente studi sia meccanicistici che terapeutici di sEV somministrati per via intratecale da varie fonti in modelli di roden. Questo protocollo può essere utilizzato per visualizzare l'assorbimento di sEV da parte delle cellule in un midollo spinale lieve e può aiutare a valutare il ruolo dei sEV e delle sue molecole di carico nei disturbi spinali, nel dolore e nell'infiammazione.
Questa procedura sarà dimostrata da me, insieme a Xuan Luo a nd Zhucheng Lin, i due studenti laureati nel laboratorio del dottor Seena Ajit. Inizia posizionando scivolate di copertura da 18 millimetri nella piastra del pozzo 12, quindi piastre le cellule neuro-2a in ciascun pozzetto con un totale di 1 millilitro di DMEM completo contenente il 10% FBS e l'1% di pen strep. Quando la fluidità della conta cellulare ha raggiunto l'80-90%, cambiare il mezzo in mezzo impoverito di esosomi DMEM in ciascun pozzo aggiungere uno, 5 o 10 microgrammi di sEV etichettati.
Per 1, 4 e 24 ore. Per l'assorbimento dipendente dalla dose e dal tempo al resto dei pozzetto ad un volume uguale di controllo del colorante. Raccogli il cervello dei cuccioli postnatali in una capsula di Petri da 60 millimetri contenente una soluzione salina bilanciata Hanks ghiacciata integrata con 10 hepes millimolari, seziona entrambi i lobi corticali e rimuovi le meningi.
Quindi tritare i tessuti con una lama sterilizzata. Trasferire i tessuti in un tubo conico da 15 millilitri contenente Pepano o desossiribonucleo un tampone di dissociazione e incubare per 20 minuti a 37 gradi Celsius, ruotando il tubo ogni 5 minuti, aspirare il surnatante e aggiungere 5 millilitri di DMEM completo al tubo. Per inattivare l'attività enzimatica, prova a valutare attentamente per dissociare i tessuti con una pipetta sierologica di vetro da 5 millilitro e una pipetta da pascolo lucidata a fiamma.
Passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri, quindi centrifugare le cellule a 250 volte G per 5 minuti a 4 gradi Celsius, aspirare il mezzo e vedere le celle in 10 millilitri di DMEM completo in un pallone da 75 centimetri quadrati. Dopo 4 ore di placcatura, sostituire il supernato e il mezzo con 15 millilitri di mezzo DMEM fresco. Dopo 14 giorni in vitro per staccare la microglia e gli oligodendrociti, trasferire il pallone in uno shaker orbitale a 320 RPM per 6 ore.
Utilizzare 5 millilitri dell'enzima di dissociazione cellulare per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Per tripinizzare, gli astrociti rimanenti, per inattivare l'azione enzimatica, aggiungere un DMEM completo di 5 millilitri e poi pellettizzare le cellule a 250 volte G per 5 minuti a 4 gradi Celsius. Risuspentare le celle in DMEM completo e vedere le celle sul coperchio numero 1.5 da 12 millimetri scivolare in una piastra da 24 pozzetti.
Usando PBS risciacquare le cellule 3 volte e poi fissarle con formaldeide o PFA al 4% di potenza in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare le celle fisse 3 volte per 5 minuti con PBS e permeabilizzarle usando lo 0,1% di Triton X 100 in PBS per 10-15 minuti. Quindi ripetere i lavaggi con PBS.
Utilizzare il siero di capra normale al 5% o NGS in PBS per 1 ora a temperatura ambiente per bloccare le cellule, incubare le cellule neuro-2a con anticorpi bidirezionali mappati e gli astrociti primari con anticorpi GFAP con un rapporto da 1 a 500 in NGS o PBS fresco del 5% durante la notte a 4 gradi Celsius con un leggero scuotimento. Dopo aver lavato le cellule 3 volte in PBS, aggiungere gli anticorpi secondari coniugati con fluoroforo in 5% NGS. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente al riparo dalla luce su un bilanciere.
Ripetere il lavaggio con PBS e incubare la cella con 1 microgrammo per millilitro di DAPI per 10 minuti a temperatura ambiente. Ancora una volta, lavare le celle 3 volte con PBS. Utilizzando un mezzo di montaggio anti dissolvenza, montare i coperchi scivola sui vetrini numero 1, lasciarli asciugare durante la notte al buio e conservare i vetrini preparati a 4 gradi Celsius fino all'imaging su un microscopio confocale.
Sezionare il midollo spinale e fissarlo in PFA al 4% in PBS a 4 gradi Celsius per 24 ore. Prima proteggere i tessuti in saccarosio al 30% in PBS a 4 gradi Celsius per 24 ore o fino a quando i tessuti affondano e quindi conservare i tessuti a 4 gradi Celsius fino all'immunoistochimica, inmbare il midollo spinale L4 L5 nel composto OCT, quindi congelarlo su ghiaccio secco fino a quando non è completamente solidificato. Utilizzare un criostato per sezionare i tessuti a 30 micrometri e raccogliere le sezioni in una piastra a 24 pozzetti contenente PBS.
Lavare le sezioni 3 volte per 5 minuti ciascuna con lo 0,3% di tritone in PBS, bloccare i siti di legame non specifici usando il 5% mgs nello 0,3% di Triton PBS per 2 ore a temperatura ambiente. Incubare le sezioni durante la notte a 4 gradi Celsius su uno shaker. Lavare le sezioni 3 volte per 5 minuti con lo 0,3% di Tritone in Pbs.
Quindi aggiungere la concentrazione appropriata degli anticorpi secondari. Secondo il manoscritto del testo, incubare a temperatura ambiente per due ore, lavare le sezioni usando solo PBS e incubarle in 1 microgrammo per millilitro di DAPI per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi ripetere i lavaggi PBS al microscopio ottico, montare le sezioni su un vetrino adesivo trasparente con un pennello fine.
Bagnare il coperchio scivolare con il mezzo di montaggio e polimerizzare durante la notte al buio a temperatura ambiente, acquisire immagini al microscopio confocale con i rispettivi laser, La dimensione media media di RA 2 6 4 0,7 sEV derivati era di 140 nanometri e la dimensione delle particelle di picco era di 121,8 nanometri. Con le particelle più rilevabili che rientrano nella gamma di dimensioni degli esosomi o sEVS. A 50-150 nanometri, il western blotting di sEV, celllysate e media esodepletati, ha dimostrato che i campioni proteici derivati da sEV contenevano le proteine marcatori sEV Alix CD81 e GAPDH.
Il lisiato cellulare è stato arricchito con reticolo endoplasmatico, proteina residente Calnexin quindi Calnexin è servito come marcatore negativo per la contaminazione cellulare in quanto era assente nei sEV. È stato osservato che l'assorbimento di sEV si è verificato a 1 ora e per i sEV da 1, 5 e 10 microgrammi, la fluorescenza post incubazione poteva essere rilevata a 4 ore, per 4, 5 e 10 microgrammi di sEV. L'assorbimento di sEV etichettati con PKH 26 da parte degli astrociti primari è stato esaminato e la massima fluorescenza dall'assorbimento di sEVS negli astrociti corticali primari si è verificata a 24 ore sono stati assorbiti sEV con marchio PKH26 e la massima fluorescenza è stata osservata a 6 ore, post-iniezione nei neuroni astrociti e cellule microgliali.
L'inclusione di controlli, sEV non etichettati e controllo del colorante crea codice per un vento falsi segnali positivi recenti a causa dell'etichettatura ora specifica Opry dance of Unbound dye patch coasts. L'assorbimento di seV può essere confermato studiando il trasferimento del carico biomolecolare alla ricetta e alle cellule e ai tessuti e determinando i cambiamenti nei livelli di espressione delle biomolecole o dei geni bersaglio. Possono anche essere eseguiti studi comportamentali, per indagare l'impatto funzionale della consegna di sEV.
