척수의 다른 세포에 의해 sEV라고도 하는 작은 세포 외 소포의 섭취를 시각화하면 sEV의 성공적인 전달을 확인할 수 있습니다. 이를 통해 로덴 모델의 다양한 소스에서 내trathecally 투여 된 sEV의 기계론 적 및 치료 연구를 가능하게합니다. 이 프로토콜은 온화한 척수에 있는 세포에 의하여 sEV upup를 구상하는 것을 이용할 수 있고, 척추 무질서, 고통 및 염증에 있는 sEV 및 그것의 화물 분자의 역할을 평가하는 것을 도울 수 있습니다.
이 절차는 저와 함께 시나 아지트 박사의 연구실에서 두 대학원생인 슈안 루오(Xuan Luo)와 함께 제일 준 주청 린(Xuan Luo)이 시연할 것입니다. 12 개의 웰 플레이트에 18 mm 커버 슬립을 배치한 다음 10 %의 FBS 및 1 % 펜 스트렙을 포함하는 완전한 DMEM의 총 1 밀리리터로 각 우물의 신경 -2a 세포를 플레이트합니다. 세포 수 유창성이 80~ 90%에 도달하면 매매체를 DMEM 엑소솜 고갈된 배지로 변경하여 각각 1, 5 또는 10 마이크로그램의 라벨이 부착된 sEV를 추가합니다.
1, 4 및 24 시간 동안. 주사제 제어의 동일한 볼륨에서 우물의 나머지 부분에 복용량 및 시간 의존 섭취량에 대 한. 60mm에서 산후 새끼의 두뇌를 수집, 얼음 차가운 행크스 균형 소금 용액을 포함하는 페트리 접시 10 밀리몰라 헤페로 보충, 피질 엽을 모두 해부하고 수막을 제거.
그런 다음 멸균 된 블레이드로 조직을 다진다. 페판 또는 데옥시리보뉴클레우스를 함유한 15밀리리터 원뿔형 튜브로 조직을 옮기고 37도에서 20분 동안 배양하고, 5분마다 튜브를 소용돌이치며, 체퍼를 흡인하고, 완전한 DMEM 5 밀리리터를 튜브에 추가한다. 효소 활성을 비활성화하려면 5 밀리리터 유리 세로지컬 파이펫과 화염 연마 목초지 파이펫으로 조직을 분리하기 위해 신중하게 평가하십시오.
40 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 통과한 다음, 섭씨 4도에서 5분 동안 250회 G로 세포를 원심분리하고, 배지를 흡인하고, 75 평방 센티미터 플라스크에서 완전한 DMEM의 10 밀리리터에서 세포를 볼 수 있습니다. 4시간 의 도금 후, 신선한 DMEM 배지의 15 밀리리터로 슈퍼네이트와 매체를 교체하십시오. 마이크로글리아와 올리고드렌드로키테를 분리하기 위해 14일 간 시험관에서 플라스크를 궤도 셰이커로 6시간 동안 320 RPM으로 옮는다.
섭씨 37도에서 10분 동안 세포 해리 효소 5밀리리터를 사용하십시오. 트립시인화하려면, 나머지 성상세포는 효소 작용을 비활성화하고 완전한 DMEM의 5 밀리리터를 추가한 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 250배 G로 세포를 펠릿합니다. 완전한 DMEM에서 세포를 다시 중단하고 24 웰 플레이트에서 12 밀리미터 번호 1.5 커버 슬립에 세포를 참조하십시오.
PBS를 사용하여 세포를 3번 헹구고 실온에서 10분 동안 PBS에서 4%의 포름알데히드 또는 PFA로 고정합니다. 고정 된 세포를 PBS로 5 분 동안 3 번 세척하고 PBS에서 0.1 % Triton X 100을 사용하여 10 ~ 15 분 동안 과미를 처리하십시오. 그런 다음 PBS로 세동을 반복합니다.
실온에서 1시간 동안 PBS에서 5%의 정상 염소 혈청 또는 NGS를 사용하여 세포를 차단하고, 신경-2a 세포를 맵 양방향 항체와 GFAP 항체로 1~500비율로 1-500비율로 배양하여 신선 5%NGS 또는 PBS를 4°C에서 4°C. PBS에서 세포를 3회 세척한 후, 5%NGS에 플루오로포레 컨쥬게이드 이차 항체를 첨가한다. 로커의 빛으로부터 보호되는 실온에서 2시간 동안 배양하세요.
PBS로 세척을 반복하고 실온에서 10 분 동안 DAPI밀리리터 당 1 마이크로 그램으로 세포를 배양하십시오. 다시 한번, PBS로 세포를 3 번 씻으십시오. 안티 페이드 장착 매체를 사용하여, 1 번 슬라이드에 커버 슬립을 장착, 그들은 어둠 속에서 하룻밤 건조하고 공초점 현미경에 이미징 때까지 섭씨 4도에서 준비 된 유리 슬라이드를 저장합니다.
척수를 해부하고 24 시간 동안 섭씨 4도에서 PBS에서 4 % PFA로 수정하십시오. 이전에는 PBS에서 30%의 자당에서 24시간 동안 또는 조직이 침몰할 때까지 조직을 섭씨 4도까지 보관한 다음, 면역작용까지 조직을 섭씨 4도에 보관하고, 10월 화합물에 L4 L5 척수를 침범한 다음, 완전히 고화될 때까지 드라이 아이스에 동결한다. 30 마이크로미터에서 조직을 절개하기 위해 극저온을 사용하고 PBS를 포함하는 24 개의 웰 플레이트에서 섹션을 수집합니다.
PBS에서 0.3%트리톤으로 5분간 섹션을 3회 세척하고 실온에서 2시간 동안 5%MGS를 사용하여 비특이적 결합 부위를 차단합니다. 셰이커에서 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 섹션을 배양하십시오. Pbs에서 0.3 %의 트리톤으로 5 분 동안 섹션을 3 번 씻으시면하십시오.
그런 다음 이차 항체의 적절한 농도를 추가합니다. 텍스트 원고에 따르면 실온에서 2 시간 동안 배양하고 PBS만 사용하여 섹션을 세척하고 실온에서 10 분 동안 DAPI 밀리리터 당 1 마이크로 그램으로 배양하십시오. 그런 다음 가벼운 현미경으로 PBS 세싱을 반복하고 미세 페인트 브러시로 명확한 접착제 슬라이드에 섹션을 장착합니다.
커버 슬립을 실온에서 밤새 마운팅 매체로 적시시키고, 각각의 레이저로 공초점 현미경으로 심상을 획득하고, 평균 평균 크기RA 2 6 4 0.7 유래 sEV는 140 나노미터이고 피크 입자 크기는 121.8 나노미터였다. 가장 검출 가능한 입자가 엑소좀 또는 sEVS의 크기 범위 내에 떨어지면 됩니다. 50 내지 150 나노미터에서, sEV, 세포 Lysate 및 외래 매체의 서쪽 블로팅은 sEV 파생 단백질 샘플이 sEV 마커 단백질 Alix CD81 및 GAPDH를 포함하고 있음을 입증했습니다.
세포 용해는 내피 성 망상, 상주 단백질 칼넥신으로 농축되었기 때문에 칼넥신은 세포 오염에 대한 부정적인 마커로서 sEV에 결석했다. sEV의 섭취량은 1시간, 10마이크로그램 sEV에 대해 발생했으며, 4시간, 5, 10마이크로그램의 sEV를 4시간 동안 배양 형광을 검출할 수 있었다. 1차 성상세포에 의한 PKH 26 표지된 sEV의 섭취를 검사하고 1차 피질 성상세포에서 sEVS 섭취량으로부터 최대 형광이 발생하였고, 24시간 PKH26 표지된 sEV를 복용하여 6시간 동안 최대 형광을 관찰하고, 뉴런 성화세포 및 마이크로글리아 세포에서 최대 형광이 관찰되었다.
컨트롤, 레이블이 없는 sEV 및 염료 제어가 포함되면 언바운드 염료 패치 해안의 특정 레이블 오프리 댄스로 인해 바람이 거짓 긍정 최근 신호에 대한 코드를 생성합니다. seV의 섭취는 조리법과 세포 및 조직에 생체 분자화물 전송을 조사하고 생체 분자 또는 표적 유전자의 발현 수준에 있는 변경을 결정해서 확인할 수 있습니다. sEV 전달의 기능적 영향을 조사하기 위해 행동 연구를 수행할 수도 있습니다.
