SEV olarak da bilinen küçük hücre dışı veziklinlerin omurilikteki farklı hücreler tarafından alınmasını görselleştirmek, SEV'lerin başarılı bir şekilde teslimini doğrulayabilir. Bu, roden modellerinde çeşitli kaynaklardan intratekal olarak uygulanan SEV'lerin hem mekanistik hem de terapötik çalışmalarını sağlar. Bu protokol, SEV'lerin hafif bir omurilikteki hücreler tarafından alınmasını görselleştirmek için kullanılabilir ve sEV'lerin ve kargo moleküllerinin omurga bozuklukları, ağrı ve iltihaplanmadaki rolünü değerlendirmeye yardımcı olabilir.
Bu prosedür, Dr Seena Ajit'in laboratuvarındaki iki yüksek lisans öğrencisi Xuan Luo ve Nd Zhucheng Lin ile birlikte benim tarafım tarafından gösterilecektir. 12 kuyu plakasına 18 milimetre kapak kayması yerleştirerek başlayın, ardından her kuyuya %10 FBS ve %1 kalem strep içeren toplam 1 mililitre tam DMEM ile nöro-2a hücrelerini plakalayın. Hücre sayısı akıcılığı %80 ila %90'a ulaştığında, her kuyuda ortayı DMEM eksozom tükenmiş ortam olarak değiştirin, bir, 5 veya 10 mikrogram etiketli sEV ekleyin.
1, 4 ve 24 saat boyunca. Doz ve zamana bağlı olarak kuyuların geri kalanına eşit miktarda boya kontrolü ile almak için. Postnatal yavruların beyinlerini 60 milimetrelik bir alanda toplayın, 10 milimolar hepes ile desteklenmiş buz gibi Hanks dengeli tuz çözeltisi içeren Petri kabı, hem kortikal lobları parçalara çıkarın hem de menenjileri çıkarın.
Daha sonra dokuları sterilize edilmiş bir bıçakla kıyın. Dokuları Pepane veya deoksiribonükleus içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve 37 santigrat derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın, tüpü her 5 dakikada bir döndürün, süpernatantı aspire edin ve tüpe 5 mililitre komple DMEM ekleyin. Enzim aktivitesini inaktive etmek için, dokuları 5 mililitre cam serolojik pipet ve alev cilalı mera pipeti ile ayrıştırmak için dikkatlice derecelendirmeye çalışın.
Hücre süspansiyonunu 40 mikrometre hücre süzgecinden geçirin ve ardından hücreleri 250 kez G'de 4 santigrat derecede 5 dakika santrifüjleyin, ortamı epire edin ve hücreleri 75 santimetrekarelik bir şişede 10 mililitrelik tam DMEM'de görün. 4 saatlik kaplamadan sonra, süpernat ve ortamı 15 mililitre taze DMEM ortamı ile değiştirin. Mikroglia ve oligodendrositleri ayırmak için 14 gün tüp bebek yaptıktan sonra, şişeyi 6 saat boyunca 320 RPM'de bir yörünge çalkalayıcıya aktarın.
37 santigrat derecede 10 dakika boyunca hücre ayrıştırma enziminin 5 mililitresini kullanın. Tripsinize için, kalan astrositler, enzimatik eylemi devre dışı bırakmak için, 5 mililitre tam DMEM ekleyin ve ardından hücreleri 4 santigrat derecede 5 dakika boyunca 250 kez G'de peletleyin. Hücreleri tam DMEM'de yeniden biriktirin ve 12 milimetrelik 1,5 kapak kaydırdaki hücreleri 24 kuyu plakasında görün.
PBS kullanarak hücreleri 3 kez durulayın ve ardından oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS'de% 4 güç formaldehit veya PFA ile sabitleyin. Sabit hücreleri PBS ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın ve PBS'de %0,1 Triton X 100 kullanarak 10 ila 15 dakika geçirgen hale getirin. Ardından yıkamaları PBS ile tekrarlayın.
Hücreleri bloke etmek için oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS'de% 5 normal keçi serumu veya NGS kullanın, nöro-2a hücrelerini harita çift yönlü antikorlarla kuluçkaya yatırın ve GFAP antikorları ile birincil astrositleri hafif bir sarsıntı ile bir gecede taze% 5 NGS veya PBS'de 1 ila 500 oranında kullanın. PBS'de hücreleri 3 kez yıkadıktan sonra, florofor konjuge sekonder antikorları% 5 NGS'ye ekleyin. Bir rocker üzerindeki ışıktan korunan oda sıcaklığında 2 saat kuluçkaya yat.
Yıkamayı PBS ile tekrarlayın ve hücreyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca mililitre DAPI başına 1 mikrogram ile kuluçkaya yatırın. Bir kez daha, hücreleri PBS ile 3 kez yıkayın. Solmaya karşı montaj ortamı kullanarak, kapak kaymalarını 1 numaralı slaytlara monte edin, karanlıkta gece boyunca kurumasını bekleyin ve hazırlanan cam slaytları konfokal bir mikroskopta görüntülemeye kadar 4 santigrat derecede saklayın.
Omuriliği parçalara ayrıştırın ve PBS'de 24 saat boyunca 4 santigrat derecede%4 PFA'da sabitle. Daha önce PBS'de% 30 sakkarozdaki dokuları 24 saat boyunca 4 santigrat derecede koruyun veya dokular batana kadar ve daha sonra dokuları immünhistokimyaya kadar 4 santigrat derecede saklayın, L4 L5 omuriliğini OCT bileşiğine koyun, sonra tamamen katılanınceye kadar kuru buzda dondurun. Dokuları 30 mikrometrede bölümlere almak ve bölümleri PBS içeren 24 kuyu plakasında toplamak için bir kriyostat kullanın.
Bölümleri PBS'de %0,3 Triton ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın, oda sıcaklığında 2 saat boyunca %0,3 Triton PBS'de %5 MGS kullanarak spesifik olmayan bağlama bölgelerini engelleyin. Bölümleri bir gecede 4 santigrat derecede bir çalkalayıcı üzerinde kuluçkaya yatırın. Pbs'de %0,3 Triton ile bölümleri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
Daha sonra ikincil antikorların uygun konsantrasyonunun eklenmesi. Metin makalesine göre, oda sıcaklığında iki saat kuluçkaya yatırın, bölümleri sadece PBS kullanarak yıkayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca mililitre DAPI başına 1 mikrogramda kuluçkaya yatırın. Ardından PBS yıkamalarını hafif bir mikroskop altında tekrarlayın, bölümleri ince bir boya fırçasıyla net bir yapışkan kaydırağa monte edin.
Kapak kaymasını montaj ortamıyla ıslatın ve oda sıcaklığında karanlıkta gece boyunca kürlayın, ilgili lazerlerle konfokal mikroskop altında görüntüler elde edin, RA 2 6 4 0.7 türetilmiş sEV'lerin ortalama ortalama boyutu 140 nanometre ve tepe partikül boyutu 121.8 nanometre idi. En tespit edilebilir parçacıklar ekzozomların veya sEVS'in boyut aralığına düşer. 50 ila 150 nanometrede, sEV'lerin batı lekesi, Hücre Lysate ve exodepleted Media, sEV türevi protein örneklerinin sEV belirteç proteinleri Alix CD81 ve GAPDH içerdiğini göstermiştir.
Hücre lisat endoplazmik reticulum ile zenginleştirilmiştir, yerleşik protein Calnexin böylece Calnexin sEV'lerde bulunmadığı için hücresel kontaminasyon için negatif bir belirteç görevi gördü. SEV'lerin alımının 1 saatte gerçekleştiği ve 1, 5 ve 10 mikrogram sEV'ler için 4 saat, 4, 5 ve 10 mikrogram sEV için kuluçka sonrası floresan tespit edilebildiği gözlendi. Birincil astrositler tarafından PKH 26 etiketli sEV'lerin alımı incelendi ve primer kortikal astrositlerde sEVS alımından maksimum floresan 24 saatte PKH26 etiketli sEV'ler alındı ve 6 saatte maksimum floresan, nöron astrositlerde ve mikroglial hücrelerde enjeksiyon sonrası gözlendi.
Kontrollerin, etiketlenmemiş sEV'lerin ve boya kontrolünün dahil edilmesi, artık ilişkisiz boya yama kıyılarının opry dansını etiketlemesi nedeniyle bir rüzgar yanlış pozitif son sinyallere kod oluşturur. SEV'lerin alımı, tarif ve hücrelere ve dokulara biyomoleküler kargo transferi araştırılarak ve biyomoleküllerin veya hedef genlerin ifade düzeylerindeki değişikliklerin belirlenmesiyle doğrulanabilir. SEV doğumunun fonksiyonel etkisini araştırmak için davranış çalışmaları da yapılabilir.
