La maggior parte del lavoro di base e traslazionale proviene da animali anestetizzati. Gli anestetici possono aggiungere variabili confondenti all'analisi e all'interpretazione dei dati. Questo lavoro consente all'imaging sveglio nei ratti di aggirare questo problema.
Questo design è abbastanza semplice. L'intero assemblaggio è leggero, quindi non compromette la normale vita dell'animale. Ciò significa che può essere utilizzato anche per l'imaging cronico a lungo termine.
Ad aiutare a dimostrare questa procedura sarà il Dr.Mehwish Bhatti, un postdoc senior del nostro laboratorio. Inizia realizzando l'impianto della testa utilizzando un software CAD per visualizzare l'area posteriore al bregma e adiacente alla linea mediana centrata sulla corteccia somatosensoriale. Assicurarsi che l'impianto cranico copra un'area da 0,9 a 1,9 millimetri sul cranio lontano dall'area di imaging.
Utilizzare solo tre viti per ancorare l'impianto della testa sul cranio del ratto. Progetta tutti i fori delle viti sul lato opposto della linea mediana nella parte controlaterale dell'emisfero dell'immagine. Per consentire ai fili di fissare il cappuccio della testa all'impianto della testa, posizionare una barra cava nella parte superiore dell'impianto della testa.
Quindi, progettare il cappuccio, assicurandosi che copra interamente l'area di imaging e la protegga da eventuali traumi. Aggiungi una curvatura alla calotta della testa in modo che si allinei alla forma della testa senza causare difficoltà alle attività quotidiane dell'animale nelle gabbie arricchite standard. Tagliare il lato interno del cappuccio in una forma rettangolare più ampia in modo che la parte superiore dell'impianto della testa possa adattarsi ad esso.
Perpendicolare a questo rettangolo, tagliare altre due regioni rettangolari per ancorare il cappuccio alla protesi della testa. Per fissare il cappuccio sulla testa del ratto, passare i fili attraverso la barra scavata superiore dell'impianto della testa. Progettare il telaio della testa in modo che una parte tagliata possa muoversi attraverso la barra superiore dell'impianto della testa e venga fissata utilizzando un morsetto.
Per rendere accessibile il lato controlaterale per l'imaging, inclinare l'altra parte tagliata per fornire una forza extra per mantenere fissa la testa del ratto. Stampa l'impianto cranico e il cappuccio della testa utilizzando la stampante 3D. Misurare il peso dell'animale per calcolare la quantità di anestetico da somministrare.
Anestetizzare l'animale iniettando pentobarbital di sodio per via intraperitoneale. Diverse alternative di anestesia possono essere utilizzate in questo intervento chirurgico come isoflurano, ketamina o xilazina. Iniettare atropina per via intramuscolare per ridurre le secrezioni di muco durante la respirazione.
Usando un tagliacapelli, radere la testa del topo iniziando tra gli occhi e la parte posteriore delle orecchie di cinque millimetri centrata attorno alla linea mediana. Quindi monitorare la saturazione parziale di ossigeno e la frequenza cardiaca utilizzando un pulsossimetro e una sonda cardiofrequenzimetro fissata alla zampa posteriore del ratto. Pulire la testa del topo e l'area circostante tre volte con Betadine e salviette alcoliche al 70% in alternativa.
Fissare il topo in un sistema stereotassico. Quindi, inserire una sonda rettale lubrificata con vaselina per misurare la temperatura corporea del ratto e mantenerla attraverso il sistema di feedback della coperta riscaldante per evitare l'ipotermia dopo la somministrazione di anestetico. Applicare unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione.
Somministrare il 2% di anestetico locale per via sottocutanea sul sito chirurgico e tre millimetri di soluzione di Ringer lattato a temperatura ambiente per via sottocutanea per prevenire la disidratazione e fornire nutrimento durante l'intervento chirurgico. Usando forbici chirurgiche affilate, rimuovere la parte della pelle sopra il sito chirurgico. Sezionare e rimuovere parte della pelle tra l'orecchio e l'occhio sulla parte temporale della testa.
Utilizzando un bisturi, rimuovere il tessuto cutaneo sottostante per esporre il cranio. Quindi pulire il cranio con una garza di cotone sterilizzata. Tagliare il muscolo temporale ed esporre l'area del cranio sull'emisfero controlaterale per l'impianto della testa.
Posizionare l'impianto di testa sul cranio per accertare la posizione delle viti di ancoraggio per l'impianto. Ora segna il teschio usando l'inchiostro dell'India per forare le viti con la punta da trapano. Praticare i fori di bava per le viti utilizzando la punta da trapano dentale tre e avvitare l'impianto della testa in posizione.
Asciugare il cranio con una garza sterile e applicare un sottile strato di adesivo tissutale intorno e sotto l'impianto della testa per incollarlo al cranio. Utilizzare il cemento dentale per sostenere ulteriormente l'impianto della testa in posizione e lasciare asciugare il cemento per due o tre minuti. Inoltre, utilizzare la punta del trapano dentale tre per ridurre lo spessore di un'area di 7,5 millimetri per 7,5 millimetri sul lato sinistro del cranio appena posteriore al bregma e laterale alla linea mediana a 50 micrometri.
Applicare un unguento antibiotico topico sul sito chirurgico e quindi coprirlo con un sottile strato di gomma siliconica per proteggere il cranio sottile. Quindi, coprire il sito chirurgico utilizzando il cappuccio della testa e fissarlo in posizione con i due piccoli pezzi di fili che attraversano sia l'impianto della testa che il cappuccio. Applicare gomma siliconica per coprire il cappuccio e il cranio per stabilizzare ulteriormente il cappuccio sulla testa del ratto.
Somministrare buprenorfina e antibiotici per via intraperitoneale per gestire rispettivamente il dolore e l'infiammazione e prevenire l'infezione. Vengono mostrati i segnali di imaging ottico dalla risposta sommata di un ratto sveglio e una singola prova di un ratto anestetizzato. La risposta funzionale del ratto fisso a testa sveglia è 140 volte più forte di quella del ratto anestetizzato.
Fare attenzione a non aggiungere troppo cemento sopra la piastra di testa. Può impedire il corretto fissaggio del cappuccio. Questo metodo può essere ampiamente applicato al neuroimaging del cranio sottile fissato dalla testa sveglia.
Con le craniotomie, può essere esteso ad altri protocolli di neuroimaging, tra cui l'imaging a ultrasuoni funzionali, l'imaging del calcio e l'imaging a fluorescenza. L'imaging sveglio consentirà un nuovo corpo di lavoro senza le variabili confondenti introdotte con gli anestetici.
