Questo miniscopio può ridurre il problema del restringimento con il cemento dentale durante la procedura della piastra di base e aumentare il tasso di successo delle registrazioni miniscope dei segnali di fluorescenza in due configurazioni di lunghezza. Se il transitorio di fluorescenza non può essere osservato durante la placcatura di base, controllare l'espressione dell'indicatore di calcio e la posizione di una lente relè sulla fetta di cervello. Iniziare con il montaggio dell'ago interno di un catetere endovenoso calibro 20 con un diametro di un millimetro sul braccio stereotassico.
Abbassare il catetere nel mais ventrale ammonis 1 nella regione target. Quindi, abbassare l'ago di microiniezione a una velocità da 100 a 200 micrometri al minuto nella cornu ammonis ventrale 1 e infondere 200 nanolitri del vettore virale nella regione bersaglio ad una velocità di 25 nanolitri al minuto. Dopo aver permesso al virus di diffondersi per 10 minuti, prelevare l'ago per microiniezione a una velocità compresa tra 100 e 200 micrometri al minuto.
Dopo aver disinfettato la lente del relè, immergerla in soluzione salina fredda priva di pirogeni fino all'impianto. Utilizzando un micro morsetto bulldog con tubi termorestringenti, tenere la lente del relè e posizionarla sopra la regione target a una velocità compresa tra 100 e 200 micrometri al minuto. Quindi, stabilizzare la lente con cemento dentale.
Per impostare un miniscopio, fissare l'obiettivo sul fondo e assemblare la piastra di base sul miniscopio. Avvolgere 10 centimetri di pellicola di paraffina intorno all'esterno della piastra di base. Utilizzando argilla adesiva riutilizzabile, tenere il miniscopio con la sonda da braccio stereotassica.
Allineare l'obiettivo sulla parte superiore dell'obiettivo relè con il minor spazio possibile tra gli obiettivi. Utilizzare il cemento dentale per garantire il posizionamento della piastra di base, in modo tale che il cemento tocchi solo il film di paraffina. Quando il cemento dentale si è asciugato, rimuovere la pellicola di paraffina, la piastra di base e il miniscopio, mantenendo la base del cemento dentale vuota.
Sigillare la lente del relè con gomma siliconica stampata e coprire la gomma siliconica con un sottile strato di cemento dentale. Sganciare il mouse dagli strumenti stereotassici e collocarlo in una camera di recupero. Per la placcatura di base, tagliare accuratamente lo strato sottile del tetto in cemento dentale con un rongeur osseo e rimuovere la gomma siliconica.
Pulire la superficie della lente del relè con alcool al 75%. Fissare la vite di fissaggio accanto alla piastra di base per fissarla alla parte inferiore del miniscopio. Regolare la diapositiva di messa a fuoco in modo che si trovi a circa 2,7-3 millimetri dall'alloggiamento principale.
Al termine dell'impostazione, collegare il miniscope alla scheda di acquisizione dati e collegare il miniscope a una porta USB 3.0 di un computer. Eseguire il software di acquisizione dati sviluppato dal team UCLA. Regolare l'esposizione a 255, il guadagno a 64x e il LED di eccitazione al 5%Per collegare il miniscope al software di acquisizione dati, fare clic sul pulsante di connessione e guardare il livestream del software di acquisizione dati considerando il margine della lente relè come punto di riferimento.
Una volta trovata la lente relè, allineare manualmente l'obiettivo del miniscopio all'obiettivo del relè. Regolando i vari angoli e distanze del miniscopio, iniziare la ricerca dei segnali di fluorescenza. Tenendo il miniscopio nella posizione ottimale, spostare il braccio stereotassico verso il mini cannocchiale e far aderire il miniscopio al braccio stereotassico con argilla adesiva riutilizzabile.
Cerca la vista migliore regolando leggermente i bracci X, Y e Z. Regolare l'angolo tra la superficie dell'obiettivo e l'obiettivo del relè ruotando la barra auricolare, la barra del dente o l'argilla adesiva riutilizzabile sull'asse Z. L'espressione virale e l'impianto del cristallino hanno successo quando almeno una cellula ha spostato i transitori di fluorescenza durante la placcatura di base.
Fissare saldamente la piastra di base con la minor quantità possibile di cemento dentale mentre si monitora la regione di interesse per garantire che la posizione ottimale non cambi. Nello studio rappresentativo, la procedura di baseplating fittizio si è rivelata vantaggiosa in quanto ha comportato uno spostamento minore nella posizione della piastra di base rispetto alla procedura originale. Lo spostamento della piastra di base è stato influenzato anche dall'altezza del cemento dentale.
La piastra di base che era ancorata 0,5 centimetri sopra il cranio si spostava significativamente meno della piastra di base che era fissata un centimetro sopra il cranio. In un esempio di imaging riuscito durante la procedura di placcatura di base, sono stati notati transitori di fluorescenza insieme ai vasi sanguigni nell'animale anestetizzato. I transitori di fluorescenza sono stati osservati cinque giorni dopo la placcatura basale anche quando il topo si comportava liberamente nella sua gabbia domestica con solo un leggero spostamento in una posizione.
È stata effettuata la successiva imaging del calcio dei topi. In alcuni casi, si sono verificati problemi durante la procedura di baseplating, come l'assenza di qualsiasi cosa tranne uno sfondo uniforme o la visibilità dei margini dei globuli bianchi. senza transitori di fluorescenza.
È importante fissare saldamente la piastra di base sulla regione target con la minor quantità possibile di cemento dentale. Con la tecnica dell'ardesia, i ricercatori possono osservare longitudinalmente l'attività neurale attraverso questo. Con la licenza appropriata, questa procedura può essere applicata anche per osservare la rete neurale nel campo visivo.
