L'obiettivo generale del seguente protocollo sperimentale, è quello di eseguire una terapia di fotobiomodulazione transcranici utilizzando bassi livelli di laser rosso nei topi. Ciò è ottenuto dal contatto diretto della sonda laser sulla testa del mouse. Come primo passo, al fine di valutare la trasmissione della luce laser, sezionare attentamente il tessuto cerebrale dal cranio.
E poi misurare il potere luminoso trasmesso attraverso il cranio più il cuoio capelluto e una fetta millimetra del tessuto cerebrale. Nella sezione terapeutica, contattare la punta della sonda laser direttamente sul cuoio capelluto al bregma. Queste funzioni di apprendimento spaziale e memoria sono valutate dall'attività del labirinto Barnes.
Successivamente, i livelli di ATP ippocampale sono determinati dal metodo spettrofotometrico. I dati di trasmissione laser mostrano che circa l'1% della luce antecedente sulla superficie del cuoio capelluto ha raggiunto una profondità millimetra dalla superficie corticale. I risultati del compito del labirinto barnes mostrano un miglioramento della memoria spaziale nei topi invecchiati dopo due settimane del trattamento laser rosso transcraniciale.
Inoltre, i risultati suggeriscono un aumento dei livelli di ATP ippocampale nei topi invecchiati trattati al laser. La fotobiomodulazione transcraniciale è un approccio terapeutico non invasivo per il trattamento di una vasta gamma di disturbi neurologici e psichiatrici e per migliorare la funzione cerebrale sana. In effetti, si ritiene che la terapia di fotobiomodulazione causi la fotodissociazione dell'ossido nitrico dalla citocromo c ossidasi nei mitocondri.
Questi a loro volta aumentano il trasporto di elettroni mitrocondriali, che alla fine porta ad un aumento della produzione di ATP. Questo metodo è un approccio sicuro ed economico per l'erogazione della luce che viene eseguito dalle radiazioni della testa utilizzando sorgenti luminose esterne tra cui laser e diodi emettitori di luce. Quasi tutte le procedure di fotobiomodulazione transcranica sono applicate con luce dal rosso al vicino infrarosso a lunghezza d'onda da 600 a 1100 nanometri, una potenza che va da uno a 500 milliwatt e la fluenza che va da uno a 20 joule per centimetro quadrato.
In un topo profondamente anestetizzato, sezionare attentamente il tessuto cerebrale dal cranio. In primo luogo, fissare il tessuto cerebrale intatto su un gel di agarosio e preparare tutti i materiali richiesti tra cui cloruro di sodio e colla. Quindi, stendere un sottile strato di colla sulla superficie del blocco di montaggio del vibratomo.
Attaccare con cura il blocco di agarosio e regolarne la posizione. Abbinare leggermente la lama del vibratomo alla superficie superiore del blocco e registrare il valore del contatore. Riempire il serbatoio del vibratomo con una normale soluzione salina ghiacciata.
Regolare la velocità e la frequenza di vibrazione del vibratomo e modificare il contatore in base al valore appropriato per ottenere uno spessore della fetta di un millimetro. Accendere il vibratoma e premere il pulsante start e tagliare il cervello trasversalmente in una fetta con uno spessore di un millimetro. In primo luogo, aggiungere una goccia d'acqua sulla superficie ottica del vetro.
Quindi, metti la fetta di cervello sul vetro. Aggiungere la goccia d'acqua su di esso e posizionare con cura il secondo vetro ottico. Si noti che una goccia d'acqua deve essere aggiunta ai limiti del campione e del vetro per evitare l'essiccazione dei tessuti e anche la diffusione leggera da superfici ruvide.
Trasferire campioni al laboratorio ottico. Impostare i dispositivi ottici e accendere il misuratore di alimentazione. Indossare occhiali protettivi per gli occhi prima di iniziare a funzionare con il dispositivo laser.
Accendere il laser e avere il fascio focalizzato sullo specchio per guidare il fascio verso l'area attiva del fotodiodo. Per prima cosa, posiziona due occhiali ottici vuoti sulla superficie del misuratore di potenza e leggi la potenza della luce trasmessa dallo schermo. Rimuovere gli occhiali vuoti e posizionare delicatamente il campione cerebrale sulla superficie del misuratore di potenza, e mettere a fuoco il fascio sulla rispettiva area del tessuto e leggere la potenza trasmessa.
Questa volta, posizionare un vetro ottico vuoto sulla superficie del misuratore di potenza e leggere la potenza della luce trasmessa. Quindi, rimuovere il vetro vuoto e posizionare leggermente un vetro ottico con teschio fresco e tessuto cuoio capelluto sulla superficie del misuratore di potenza. Mettere a fuoco il fascio sul bregma e leggere la potenza trasmessa.
Infine, spegnere il dispositivo laser e il misuratore di potenza. La sezione terapeutica dell'attuale protocollo include l'applicazione degli strumenti laser di classe 3B e ciò richiede adeguate linee guida per l'allenamento e la sicurezza. Per adattare gli animali al nuovo ambiente, porta i topi dalle loro gabbie di casa nella sala di terapia circa 20 minuti prima di iniziare il trattamento.
In primo luogo, inserire la spina del dispositivo laser in una protezione elettrica. Coprire la punta della sonda laser con una pellicola di nylon trasparente per evitare qualsiasi graffio sulla superficie della sonda. Collegare con cura la sonda laser al canale del dispositivo.
Indossare occhiali protettivi per gli occhi prima di iniziare a funzionare con il dispositivo laser. Accendere il dispositivo laser e attendere alcuni secondi per il suo riscaldamento. Dopo aver osservato il segno Laser Ready sul pannello del dispositivo, regolare i parametri di trattamento, inclusi il tempo di irradiazione e la modalità di funzionamento.
Prima di iniziare il trattamento, determinare la potenza media del laser contattando la punta della sonda nell'area attiva del misuratore di potenza sul dispositivo. Nel protocollo corrente, la sonda laser è posizionata sulla zona del bregma, che è di circa tre millimetri rostrale a una linea tracciata tra la base anteriore delle orecchie. Al fine di evitare radiazioni dirette agli occhi dell'animale, posizionare prima la punta della sonda laser sulla testa, quindi accendere il laser e tenere stabilmente la sonda fino al completamento dell'irradiazione.
Quindi, spegnere il dispositivo laser e scollegare la sonda dal dispositivo. Al termine della procedura, pulire la sonda laser con un detergente ottico appropriato. L'attività di apprendimento spaziale e memoria viene eseguita in un labirinto barnes.
In primo luogo, posizionare il segno di non inserire all'esterno della porta della sala attività. Attaccare segnali spaziali visivi alle pareti perimetrali. Posizionare una videocamera sopra la piattaforma del labirinto.
Pulire la superficie della piattaforma di labirinto con il 70% di etanolo per rimuovere i segnali olfattivi indesiderati. Aggiungi una piccola quantità di biancheria da letto dalla gabbia domestica dell'animale nella scatola di fuga per fungere da segnale olfattivo. Prima di iniziare l'attività, metti ogni topo nella nuova gabbia e trasferisci la gabbia nella stanza del labirinto di Barnes.
Per abituare, lasciare che l'animale rimanga nella stanza per 30 minuti prima dell'attività. Quindi, rimuovere il mouse dalla sua gabbia e posizionare delicatamente l'animale nella scatola di fuga e lasciare che rimanga lì per un minuto. Dopo un minuto, rimuovere delicatamente il mouse dalla scatola di fuga, posizionare l'animale al centro dell'arena e mettere la camera di partenza su di esso.
Dopo un periodo di dieci secondi, solleva la camera di partenza e consenti all'animale di esplorare l'arena per tre minuti. Spostati tranquillamente nell'area del computer, indossa cuffie e attiva uno stimolo uditivo negativo costituito da un forte rumore bianco. Quindi, inizia a videotaping e osserva il comportamento dell'animale sul monitor del computer.
Si noti che un labirinto nero deve essere utilizzato per testare topi bianchi. Inoltre, un tappetino nero dovrebbe essere posizionato sotto il labirinto nel caso in cui venga utilizzato il software del sistema di tracciamento. Impostare il programma software di tracciamento video ed estrarre i parametri di interesse dai video registrati.
Per una valutazione biochimica, sezionare i tessuti dell'ippocampo, omogeneizzarli in un tampone campione, centrifugarlo e quindi valutarne i livelli di ATP utilizzando il metodo spettrofotometrico. La trasmissione della luce laser di 660 nanometri attraverso il cranio più il cuoio capelluto dei topi invecchiati era di circa il 16%Inoltre, il valore di circa il 10% è stato misurato come trasmittanza laser attraverso una fetta di un millimetro di tessuto cerebrale invecchiato. Non vi sono state differenze statisticamente significative nel registro dell'attività motoria nella prova a campo aperto tra tutti i gruppi sperimentali.
I dati del compito del labirinto Barnes hanno mostrato che i tempi di latenza degli animali di controllo invecchiati sono ovviamente più lunghi di quelli del giovane gruppo di controllo nel terzo e quarto giorno della sessione di allenamento. Tuttavia, il trattamento laser rosso ha ridotto significativamente il tempo di latenza il quarto giorno. Nella sessione di prova prop, gli animali di controllo invecchiati trascorrono tempi significativamente più brevi nel quadrante bersaglio rispetto ai giovani animali di controllo.
Tuttavia, i topi invecchiati trattati al laser hanno trascorso tempi significativamente più lunghi nei quadranti bersaglio rispetto ai topi di controllo invecchiati. I dati sui bioenergetici ippocampali rivelano una diminuzione dei livelli di ATP negli animali di controllo invecchiati. D'altra parte, il trattamento laser rosso aumenta significativamente il contenuto medio di ATP nell'ippocampo dei topi invecchiati.
Abbiamo descritto il protocollo per il laboratorio che conduce una procedura di terapia di fotobiomudulazione transcranico nei topi. Il nostro protocollo può essere adattato a qualsiasi altro animale da laboratorio che viene frequentemente utilizzato nel campo delle neuroscienze trascizionali, come coniglio, cane, scimmia, eccetera. Sulla base della nostra indagine, bassi livelli di luce rossa possono recuperare la disfunzione ippocampale nel cervello invecchiato aumentando la produzione di ATP, che si riflette in una funzione di memoria spaziale migliorata.
In questo metodo, basato su quali regioni cerebrali sono applicate dalla patologia, diversi parametri fisici e di trattamento, tra cui il tempo di irradiazione, l'intervallo di trattamento, la luminosità applicata e la fluenza, devono essere regolati in modo ottimale per ottenere risultati migliori. La terapia di fotobiomodulazione transcraniciale è proposta come un approccio promettente per migliorare il metabolismo cerebrale e il miglioramento cognitivo che potrebbe essere una potenziale strategia per il declino cognitivo legato all'età e le malattie neurodegenerative.
