Questo protocollo può essere utilizzato per identificare il ruolo di specifici bersagli molecolari individuali nella regolazione dell'attività elettrocorticografica durante diversi stati di Vigilin. Tra i vantaggi dell'utilizzo del virus adeno-associato c'è la capacità di colpire con precisione una determinata regione del cervello e un tipo di cellula specifico. A dimostrare il protocollo sarà Julien Dufort-Gervais, un ricercatore associato del mio team.
Dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pizzico in un topo anestetizzato di 12 settimane, utilizzare un tagliacapelli per radere i capelli dalla parte posteriore delle orecchie alla parte anteriore della testa tra gli occhi. Aggiungere una generosa goccia di unguento oftalmico a ciascun occhio per prevenire la disidratazione e utilizzare le barre auricolari per fissare con cura la testa del mouse su un apparecchio stereotassico. Estrarre delicatamente la lingua dalla bocca per evitare il soffocamento.
Fissare il naso del mouse all'apparecchio e utilizzare il 70% di etanolo per sterilizzare la pelle esposta sulla testa. Tenendo la pelle con pinza Graefe extra-fine, utilizzare forbici di tessuto per tagliare la pelle dalla base delle orecchie al livello degli occhi e posizionare due morsetti chirurgici su ciascun lato dell'incisione per allungare la pelle e per esporre il cranio. Evitando le suture cerebrali, utilizzare una punta a forbice per graffiare la superficie del cranio per rimuovere il periosteo e creare striature sovrapposte in due o più direzioni.
Utilizzare il 70% di etanolo per rimuovere i frammenti ossei e disinfettare il cranio. Con una cannula precedentemente preparata fissata al braccio stereotassico, identificare la posizione del bregma e della lambda e annotare le coordinate stereotassesche di ciascuna. Utilizzare il braccio stereotassico e una penna per segnare la posizione della cannula sul cranio 1,5 millimetri lateralmente a destra della linea mediana e 1,5 millimetri anteriore al bregma.
Utilizzando una punta da trapano da 0,7 millimetri, perforare con cura il cranio nella posizione contrassegnata perpendicolarmente alla superficie del cranio e allineata con l'asse verticale e lavare il cranio con una punta di cotone sterile imbevuta di una soluzione di iodio povidone betadine al 10%, quindi ritrarre lo stantuffo di una siringa da 10 microlitri di un microlitro per caricare la cannula con una bolla d'aria di un microlitro. Quindi, mescolare la miscela AAV di interesse con pipettaggio lento e aggiungere 1,7 microlitri della miscela a una capsula di Petri sterile. Utilizzare questa siringa per caricare 1,5 microlitri della soluzione nella cannula e contrassegnare la posizione della bolla d'aria sul tubo PE50 collegato.
Allineare verticalmente la cannula con il foro nel cranio in modo tale che la cannula raggiunga il bordo superiore dell'osso e segnare la coordinata Z della superficie del cranio. Abbassare lentamente la cannula fino a raggiungere 1,5 millimetri sotto la superficie del cranio e lo strato cinque della corteccia motoria e avviare la pompa della siringa a una portata di 0,025 microlitro al minuto per erogare un microlitro di AAV per 40 minuti. Utilizzare la bolla d'aria nel tubo per tracciare l'iniezione, apportando le eventuali regolazioni necessarie.
Quando l'intero volume di virus è stato consegnato, lasciare la cannula in posizione per cinque minuti per garantire una diffusione sufficiente ed evitare il riflusso prima di sollevare lentamente e con attenzione il braccio stereotassico per rimuovere la cannula dalla corteccia. Per l'impianto di elettrodi, utilizzare una pinna Kelly dritta per avvitare lentamente un elettrodo elettrocorticografico con un filo d'oro dritto nell'asse verticale del foro in cui è stato iniettato l'AAV, lasciando almeno 2,5 millimetri di vite all'esterno del cranio per ridurre al minimo il danno alla dura e alla corteccia cerebrale. Utilizzare una penna per contrassegnare la posizione dell'elettrodo di riferimento di 2,6 millimetri lateralmente a destra della linea mediana e di 0,7 millimetri posteriore al bregma e la posizione dell'elettrodo elettrocardiografico posteriore a 1,5 millimetri lateralmente a destra della linea mediana e 1,5 millimetri anteriore alla lambda e le posizioni di tre viti di manutenzione sull'emisfero sinistro senza coordinate specifiche, ma il più distanti possibile l'uno dall'altro e dagli elettrodi elettrocorticografici.
Utilizzare il trapano per perforare con cura il cranio perpendicolare alla superficie del cranio nelle posizioni marcate degli altri elettrodi e viti e lavare il cranio forato con una soluzione di iodio povidone al 10%. Bloccare i fori con piccoli pezzi laminati di delicata pulizia prima di installare le viti per prevenire sanguinamento e contaminazione e utilizzare pinna Kelly diritta per inserire le viti nei fori di perforazione con la stessa angolazione con cui sono stati perforati i fori. Posizionare alcune piccole gocce di cemento dentale al centro dello spazio ad anello all'interno delle viti e utilizzare una pinza Graefe extra-fine per sollevare la pelle sopra i muscoli del collo.
Usando la pinca numero cinque di Dumont, tenere l'estremità curva di un elettrodo elettromiografico e inserirla di circa uno o due millimetri nei muscoli. Posizionare il lato curvo e il punto di piegatura dell'elettrodo nel cemento dentale e inserire il secondo elettrodo elettromiografico nello stesso modo. Dopo aver coperto gli occhi dell'animale, applicare la luce per tre-cinque minuti per solidificare il cemento e utilizzare cemento dentale aggiuntivo per coprire la base degli elettrodi elettrocorticografici e le viti di ancoraggio per formare un contorno a forma di corona.
Dopo aver applicato altri tre o cinque minuti di luce, riempire il centro del montaggio con cemento acrilico e rimuovere i morsetti chirurgici. Utilizzare una sutura monofilamento sintetica assorbibile per chiudere la pelle nella parte anteriore e posteriore del montaggio in modo che il cranio non sia esposto e utilizzare una pince curva per tenere il connettore sopra il montaggio per allineare attentamente i fili dorati degli elettrodi con i pin del connettore, quindi saldare rapidamente ogni estremità dell'elettrodo a un singolo pin del connettore corrispondente. Dopo aver rimosso il mouse dal telaio, coprire lo spazio vuoto tra il connettore e la testa con il cemento acrilico.
E dopo aver pesato, metti il mouse in una gabbia pulita con un coperchio non a maglie su un termoforo. Due settimane dopo l'intervento chirurgico, collegare i mouse ai cavi di registrazione e almeno una settimana dopo, registrare i segnali elettrocorticografici ed elettromiografici per 24 ore o più. Un'infezione di successo è confermata dalla colorazione HA dei neuroni all'interno della corteccia motoria che circonda il sito di iniezione, indicando la presenza di cofilin S3D HA. La co-colorazione con il marcatore neuronale eccitatorio CaMKII alfa indica una chiara cofilina S3D HA e CaMKII alfa co-espressione ad alto ingrandimento.
Gli spettri di potenza relativa trasformati in log per la veglia, il sonno a onde lente e il sonno paradossale mostrano differenze specifiche dello stato nell'attività spettrale sotto inattivazione della cofilina. La combinazione di registrazione elettrocorticografica e manipolazione mediata da AAV di precisi bersagli molecolari è applicabile anche a più regioni del cervello e ad altri sottocampi delle neuroscienze come la ricerca sull'epilessia o sulla memoria oltre al sonno.
