Questo protocollo può acquisire cinetica in tempo reale a livello di singola cella. Possiamo misurare i singoli parametri cellulari in risposta all'infezione da HIV e associare eventi di segnalazione precoce a passaggi ritardati del ciclo di vita virale. Questa è un'alternativa scalabile integrata ai metodi di imaging tradizionali che utilizzano una nuova piattaforma optofluidica per lo smistamento, la ristrutturazione, l'imaging e l'automazione del software a cella singola.
Questo è il primo metodo stabilito per la coltura e l'imaging nanofluidici, ad alta produttività e longitudinali a singola cellula. Questa tecnica può essere ampiamente adottata per studiare la cinetica del segnale cellulare e le interazioni molecolari dinamiche in una varietà di stati di malattia. La dimostrazione visiva di questo metodo è importante per trasmettere come viene impostato l'esperimento, come le cellule vengono ordinate otticamente in penne e come impostare le infusioni attraverso il chip.
Per iniziare, preparare una soluzione di carico Fluo-4 AM fresca aggiungendo 25 microlitri di solvente detergente concentrato 100X e 2,5 microlitri di 1.000X Fluo-4 AM a un tubo da 1,5 millilitri, quindi vortice da mescolare. Pipetta 2,5 millilitri di mezzi di coltura nella soluzione di carico e invertire la miscela. Centrifugare due milioni di cellule MT-4 a 500 volte G per tre minuti, quindi rimuovere il supporto e rimosogliere il pellet in due millilitri della soluzione di carico Fluo-4 AM preparata.
Pipetta ha sospeso le cellule in una piastra di Petri di 35 millimetri. Incubare a 37 gradi Celsius per 15-30 minuti, quindi incubare per altri 15-30 minuti a temperatura ambiente. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifuga e centrifugare le cellule a 500 volte G per tre minuti, quindi rimuovere il supernatante.
Rimorsi il pellet cellulare con pipettando in un millilitro del mezzo di coltura e centrifugando a 500 volte G per tre minuti per lavarlo. Rimorsiva il pellet cellulare con pipettando nel mezzo di coltura ad una concentrazione di due milioni di cellule per millilitro per almeno 50 microlitri. Per preparare un chip con la soluzione di bagnatura, che facilita la penning cellulare, caricare tubi di centrifuga contenenti due millilitri di soluzione bagnante e 50 millilitri di acqua deionizzata sullo strumento con un nuovo chip optofluidico ed eseguire la funzione del chip bagnato che inonderà il chip con la soluzione bagnante.
Incubare il chip a 50 gradi Celsius e sciacquare il truciolo con acqua tre volte. Una volta fatto lo sciacquone dell'acqua, sciacquare il chip con tre cicli di 250 microlitri di mezzi di coltura. Integrare la sospensione cellulare del passaggio precedente con una per 100 parti di soluto detergente F127 prima del caricamento per ridurre la probabilità che le cellule si attacchino ai canali del chip.
Utilizzare l'ago di esportazione dello strumento per importare celle da un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri con il funzionamento di carico e l'importazione di piccoli volumi per un volume di confezione di celle a cinque microlitri. Celle a penna che utilizzano un posizionamento optoelettronico ottimizzato o una tensione OEP di 4,3 volt e cinque micrometri al secondo di velocità della gabbia utilizzando la funzione auto-penna, che rileverà automaticamente singole celle, le circonderà con una gabbia OEP e le sposterà in una penna vicina. Se le celle di interesse rimangono dopo la scrittura automatica, utilizzare la funzione penna manuale per selezionare le celle di destinazione e una penna di destinazione.
Una volta completato il penning, sciacquare il chip con tre cicli di 250 microlitri di mezzi di coltura per cancellare eventuali celle nonpennate rimanenti dal chip. Dopo aver scritto le celle, ottenere immagini fluorescenti di cellule nei canali FITC, Texas Red e DAPI per misurare la linea di base Fluo-4, mCherry e autofluorescenza. Infondere HIV-1 nel microchip ad una concentrazione di 13 nanogrammi di NLCI HIV-1 per due milioni di cellule intubando lentamente la sospensione nel chip attraverso l'ago da esportazione.
Immediatamente dopo l'aggiunta di HIV-1, ottenere ripetutamente immagini nei canali FITC e DAPI in un corso di 10 minuti. Ottenere immagini nei canali Texas Red e DAPI a uno, due, tre e quattro giorni dopo l'infezione. Questa metodologia è stata utilizzata per l'identificazione e il raggruppamento di cellule infettate da HIV e non infette mediante misurazione mCherry.
Le cellule con un cambiamento nel segnale mCherry maggiore o inferiore a 40.000 intensità fluorescente media sono state raggruppate rispettivamente nella bassa popolazione mCherry alta o mCherry. Questi cluster sono stati analizzati per la cinetica dell'afflusso di calcio misurando il calcio intracellulare usando ripetutamente la fluorescenza Fluo-4 in un corso di nove minuti, che ha dimostrato l'afflusso precoce di calcio nelle cellule infettate dall'HIV. È stata osservata una significativa correlazione positiva tra l'afflusso di calcio e la florescenza mCherry.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di iniziare con le cellule all'interno dell'intervallo di crescita esponenziale sia per la produzione di virus che per l'infezione perché le cellule invase si tradurranno in una drastica diminuzione del segnale da questo saggio. Lavorare con HIV-1 può essere pericoloso. Pertanto, le pratiche BSL-2 come indicato nello standard OSHA Bloodborne Pathogen devono sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
Questa tecnica è eccitante perché ci permetterà di studiare i cambiamenti fenotipico o trascrizionale a cella singola in condizioni controllate. Questo ha un ampio potenziale per correlare l'impatto degli stimoli sulle vie molecolari in molti tipi di cellule.
