Ringraziamo E. Massicotte e J. Signore per l&#39;assistenza tecnica di esperti durante citometria a flusso e gli esperimenti di separazione delle cellule. Inoltre, vorremmo ringraziare il personale della clinica IRCM e tutti i donatori per la fornitura di campioni di sangue. Campioni di sangue periferico sono stati ottenuti da donatori adulti sani, che hanno firmato un consenso informato in accordo con la Dichiarazione di Helsinki sotto protocolli di ricerca approvati dal etica della ricerca board review del Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM). I seguenti reagenti sono stati ottenuti attraverso il Programma reagente NIH AIDS, Divisione di AIDS, NIAID, NIH: cellule MT4 del dottor Douglas Richman; e rIL-2 umane del dottor Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc. Il dottor Cohen è il destinatario del Canada Research Chair in Retrovirology umana. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal CIHR (CIHR 111.226) per il dottor Cohen e dal Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) rete AIDS Dr. Bego e il dottor Cohen.

Note generali È importante mantenere cellule in coltura senza antibiotici, poiché le infezioni batteriche anche controllati possono essere percepiti da PBMC. Tale rilevazione di componenti batteriche indurrà uno sfondo la produzione di interferone, che non può essere distinto da quello innescato da specifici HIV-1 di rilevamento. Inoltre, tutte le cellule devono essere regolarmente testato per l&#39;assenza di contaminazione da micoplasma. Usare sempre soluzioni senza endotossine quando possibile. Citometria a flusso caratterizzazione delle diverse cellule da utilizzare in co-colture (PBMC, pDCs, MT4 e cellule T CD4 +) è un passaggio facoltativo, ma altamente consigliata dato che può fornire preziose informazioni necessarie per la corretta interpretazione di un dato esperimento. 1. Preparazione di cellule bersaglio infette <ol><li> Mantenere umano linea di cellule CD4 + T MT4 in RPMI 1640 mediun addizionato con siero fetale bovino 10% (FBS), cui d&#39;ora in poi come RPMI-1640 terreno completo. </li><li> L&#39;isolamento di cellule T CD4 + primaria. <ol><li> Isolare le cellule mononucleate del sangue periferico umano mediante centrifugazione a gradiente di densità. </li><li> Isolare linfociti T CD4 + utilizzando un kit di selezione negativa cellule T CD4 +, seguendo le raccomandazioni del costruttore. </li><li> Attiva linfociti T CD4 + con PHA-L (5 mg / ml) per 48 ore e poi mantenere cellule in RPMI-1640 integrato con terreno completo ricombinante IL-2 (100 U / ml). Infettare primaria cellule T 5 giorni dopo l&#39;isolamento. </li></ol></li><li> L&#39;infezione di cellule bersaglio (linea di cellule MT4 T o cellule eterologhe primarie T CD4 +). <ol><li> Due giorni prima di co-coltura, infettare le cellule T con virus HIV-1. Nell&#39;esempio specifico qui descritto sono stati utilizzati pNL4.3-GFP_ires_Nef wild type (WT) o pNL4.3-GFP_ires_Nef delta Vpu (dVpu) virus. Questi ceppi virali rappresentano greit proteina fluorescente (GFP) segnata con cloni molecolari infettivi isogeni che differiscono solo per la capacità di esprimere Vpu. </li><li> Utilizzare diverse molteplicità di infezione (MOI) e selezionare colture con livelli simili di infezione per i co-culture. Il giorno della co-coltura, determina la percentuale di GFP + cellule mediante citometria a flusso come marcatore di infezione. Utilizzare solo le culture, con un intervallo di 20-50% cellule infette per co-culture. </li></ol></li></ol> Passaggi facoltativi: Eseguire citometria a flusso colorazione a questo punto per valutare l&#39;espressione superficiale di molecole / ligandi di interesse come BST2, e CD4. Per la colorazione della superficie cellulare, risospendere 0,5 x 10 6 cellule T in 100 ml di soluzione di lavaggio, aggiungere 1 ml di anti-CD4_PerCP / Cy5.5 e 1 ml di anti-BST2_A660. Incubare le provette per 45 min a 4 ° C, prima di lavare con citofluorimetria soluzione di lavaggio. Se gli studi sono volti a valutare il ruolo di Vpu mediata antagonismo BST2, eseguire un HIV-1 particellasaggio di rilascio in questo momento come descritto in precedenza 15. 2. Isolamento e arricchimento delle celle sensorie (PBMC intere o pDCs arricchito) Nota: quando PBMC vengono utilizzati per il rilevamento, avviare isolamento all&#39;interno mezz&#39;ora dopo la raccolta del sangue e condotta in modo tempestivo. Utilizzare immediatamente PBMC per co-culture o pDC arricchimento. <ol><li> Isolare le cellule mononucleate del sangue periferico umano mediante centrifugazione a gradiente di densità. Passaggio facoltativo: Eseguire multi-parametrica citometria a flusso colorazione a confermare che i PBMC appena isolate contengono le diverse linee cellulari a rapporti fisiologici. Per la colorazione della superficie cellulare, risospendere 10 6 PBMC in 100 ml di soluzione di bloccaggio Fc, e incubare per 15 minuti a 4 ° C. Dopo il blocco, aggiungere 1 ml di anti-CD3_Pacific blu (per le cellule T), 1 ml di anti-CD14-PE_Texas rosso (per le cellule mieloidi), 4 ml di anti-BDCA2_APC e 1 ml di anti-ILT7_PE (per pDCs). Covaretubi per 45 minuti a 4 ° C, prima di lavare con citometria a flusso soluzione di lavaggio. </li><li> Arricchisci pDCs utilizzando un kit di selezione negativa pDC, seguendo le raccomandazioni del costruttore. Si raccomanda di lavorare velocemente, mantenere le cellule freddo, e utilizzare soluzioni pre-raffreddati. Questo consentirà di evitare il livellamento di anticorpi sulla superficie delle cellule e l&#39;etichettatura delle cellule non specifici e garantendo massima attività PDC. <ol><li> Eseguire multi-parametrica citometria a flusso delle pDCs appena isolate per confermare la purezza, la percentuale di arricchimento, e quantità relative di pDC- marcatori di superficie specifici (come ILT7 e BDCA2). Per la colorazione della superficie cellulare, risospendere 10 4 pDCs in 100 ml di soluzione di bloccaggio Fc, e incubare per 15 minuti a 4 ° C. Dopo il blocco, aggiungere 1 ml di anti-CD3_Pacific Blu, 1 ml di anti-CD14_PE_Texas Rosso, 4 ml di anti-BDCA2_APC e 1 ml di anti-ILT7_PE. Incubare le provette per 45 minuti a 4 ° C, prima di lavare con citometria a flusso soluzione di lavaggio (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS). Si raccomanda un minimo di 40% di purezza PDC (se il materiale di partenza è lo 0,4% pDC, questo sarebbe equivalente a un arricchimento 100 volte). </li></ol></li></ol> 3. Co-coltura di cellule infettate T CD4 + e celle sensorie (PBMC intere o pDCs arricchito) <ol><li> Miscelare 220 ​​ml di PBMC (diluito a 850.000 cellule / ml) o 220 ml di pDC (ad una concentrazione compresa tra 100.000 a 500.000 cellule / ml) con 30 ml di cellule T infettate (diluiti a 10 6 cellule / ml) per pozzetto in una piastra ben U-bottom 96. <ol><li> Come controlli, PBMC piastra o pDCs e cellule T da solo. Regolare il volume in ben 250 microlitri con RPMI 1640 terreno completo. </li><li> Valutare risposte cellulari agonisti nota dei percorsi TLR7 e TLR9. A tal fine, piastra 220 ml di PBMC (diluito a 850.000 cellule / ml) o 200 ml di pDC (ad una concentrazione compresa tra 100.000 a 500.000 cellule / ml) per pozzetto in una U-bottom 96 pozzetti e aggiungere TLR7 agonisti ( Imiquimod, concentrazione finale: 2,5 mg / ml) o TLR9 agonisti (ODN 2216 CpG-A, concentrazione finale: 5 micron). Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 per 18-22 ore ed elaborarli in un modo simile a co-colture di seguito descritte. </li></ol></li><li> Incubare co-colture a 37 ° C e 5% di CO 2 per 18-22 ore, e poi trasferirli su un piatto ben 96 V-parte inferiore. Centrifugare per 5 min a 400 x g. <ol><li> Trasferimento surnatanti di una piastra ben a fondo piatto 96. Supernatanti possono essere conservati a -80 ° C o utilizzati per il rilevamento di tipo I IFN subito. </li><li> Risospendere le cellule co-coltivate in 2% paraformaldeide e analizzarli in citometria a flusso. A causa delle differenze in termini di dimensioni e di granulazione, le cellule MT4 sono facilmente distinguibili da PBMC o pDCs in base al loro fianco scatter (SS) rispetto forward-scatter (FS) profili. Se le cellule T primarie sono utilizzate come cellule bersaglio infettate, questi possono essere colorati con il colorante inseguitore cellulare, quali CSFE, prima della co-coltura. </li></ol></li><li> Misura di bioattivo di tipo I IFN utilizzando cellule beta giornalista HEK-Blu-IFN alfa /. Nota: Queste cellule sono stati generati da trasfezione stabile di cellule HEK293 con i geni stat2 e IRF9 umane per ottenere un tipo completamente attivo IFN percorso di segnalazione. Essi contengono anche la fosfatasi alcalina secreta (SEAP) gene reporter sotto il controllo di IFN-α / ß inducibile ISG54 promotore. La stimolazione di queste cellule di tipo I-IFN attiva la JAK / STAT / ISGF3 pathway e induce la produzione di SEAP. <ol><li> Mantenere le cellule HEK-Blue IFN-α / ß in DMEM supplementato con 10% FBS. Li piastra a una densità di 50.000 cellule per pozzetto in una piastra a fondo piatto ben 96, in un volume finale di 180 microlitri. </li><li> Aggiungere 20 ml di co-coltura supernatante in ciascun pozzetto in duplicato. Ciascuna piastra richiede anche una serie di controlli standard interno (IFNα umana, concentrazione finale da 100 U / ml a 2500 U / ml). Incubare le piastre a 37 ° C e 5% CO 2 per 18-22 Ore. </li><li> Determinare i livelli di attività di fosfatasi alcalina con soluzione QUANTI-Blue, che cambia dal rosa al viola / blu in presenza dell&#39;enzima. Preparare QUANTI-Blue seguendo le raccomandazioni del costruttore. Aggiungere 180 ml di questa soluzione in ciascun pozzetto di una piastra a fondo piatto ben 96. Per ogni bene aggiungere anche 20 l di HEK-Blue IFN-α / beta cellule sopranatanti indotti, e incubare la piastra a 37 ° C incubatore fino colore si sviluppa nei pozzetti di controllo IFN standard. </li><li> Valutare livelli di SEAP utilizzando uno spettrofotometro a 620-655 nm e determinare la concentrazione di IFN di tipo I per estrapolazione dalla parte lineare della curva standard IFN. </li></ol></li></ol>

<ol>
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I protocolli descritti qui misurano rilevamento delle cellule T con infezione da HIV-1 virus GFP-tagged che differiscono solo per la capacità di esprimere Vpu, come descritto nella nostra recente relazione 18. Tuttavia, questi metodi possono essere facilmente modificati per studiare rilevamento di virus senza tag e virus privi altri geni virali che potrebbero potenzialmente modulare sensing innata. Se i virus usati non esprimono GFP, la percentuale di cellule bersaglio infette devono essere determinati da un altro mezzo prima di co-coltura, come il p24 (capside) colorazione intracellulare e citometria a flusso o p24 ELISA. Inoltre, questi protocolli possono essere usati con differenti cellule bersaglio T, tra cui una varietà di linee cellulari disponibili e cellule primarie. I metodi descritti in questo manoscritto hanno un numero di vantaggi rispetto ai primi metodologie utilizzate per studiare HIV-1 sensing. Innanzitutto è stato stabilito da una serie di gruppi che libera HIV-1 pgli articoli sono poveri induttori di tipo I IFN 2,13,14. Inoltre, i primi studi invocato più vecchi metodi basati-ELISA IFNα per quantificare la quantità di tipo I IFN prodotto. Un limite di questa tecnica di rilevamento è che la maggior parte dei vecchi kit ELISA IFNα misurare un solo tipo di IFNα, mentre si affaccia gli altri tipi di IFNα e Interferone beta. L&#39;utilizzo delle linee cellulari giornalista descritte supera questa limitazione come la concentrazione di tutte le forme bioattive di IFN di tipo I umano può essere misurato in una volta. La tecnica è molto sensibile, meno costoso di una nuova generazione di kit ELISA IFN e per molti donatori grandi quantità di IFN di tipo I possono essere facilmente individuati. Tuttavia, questo protocollo può essere facilmente adattato per l&#39;uso con altri di tipo I-IFN metodi di read-out, come ELISA. Passaggi critici: E &#39;importante che la qualità di tutti i componenti cellulari (sia di obiettivi che effettori) essere controllati strettamente. Potenziale contaminazione, anche quando asymptomatica, deve essere monitorato e controllato. Come abbiamo accennato in precedenza, antibiotico-controllato contaminazione batterica asintomatica, e potenzialmente di altri agenti patogeni intracellulari come micoplasma, in grado di generare risposte immunitarie simili a quelli osservati dopo da HIV-1, vale a dire la produzione di tipo I IFN. Inoltre, tutti i reagenti devono essere liberi di LPS o altri potenziali endotossine. Allo stesso modo, il monitoraggio di PBMC e pDCs è anche importante dal momento che i campioni umani possono spesso essere trattate da infezioni in corso sottostanti, che possono influenzare il rilevamento normale. Si consiglia sempre inclusi i controlli negativi proposte, quali l&#39;assenza di cellule bersaglio, nonché co-colture con cellule mock-infettate. La vitalità delle cellule infettate è importante anche per il corretto rilevamento pDC dal tipo I IFN non è prodotto a seguito della co-coltura con cellule apoptotiche 2,14. Una importante limitazione della tecnica è la necessità di cellule primarie appena isolate. Questa procedura non è statatestato con PBMC o pDCs che erano o precedentemente congelati o tenuti in coltura. L&#39;isolamento delle PBMC è laborioso e queste cellule hanno una durata di vita molto limitata. Inoltre, dovrebbero essere utilizzati protocolli standard per la protezione contro i patogeni ematica mentre si lavora con sangue umano. Ci sono spesso diverse fonti di variabilità associati con il lavoro che coinvolgono le cellule umane appena isolate. Tra loro ci sono le diverse procedure adottate per isolare queste cellule, e la variabilità ereditata incontrate dal donatore a donatore. Mentre è impossibile evitare variabilità tra donatore, l&#39;uso dei controlli positivi proposti, come la misurazione risposta agli agonisti conosciuti di TLR7 e TLR9 percorsi, fornirebbe un importante controllo interno per questi esperimenti. Abbiamo osservato che una risposta forte agli agonisti del percorso TLR9 potrebbe essere correlato con una risposta pDC sano, mentre è previsto un percorso reattivo TLR7 una risposta adeguata contro l&#39;HIV-1 3. altri 2, spesso non è necessario un arricchimento di pDCs da PBMC. Tuttavia, se il disegno sperimentale richiede (ad esempio nel contesto in cui è necessaria la deplezione di specifici marcatori di superficie PDC) selezione negativa è preferibile rispetto selezione positiva, come cellule restano liberi di anticorpo dopo il processo di selezione. Isolato pDCs subiscono una rapida apoptosi in coltura. Per gli esperimenti che richiedono queste cellule siano coltivate per lungo periodo di tempo, terreni di coltura possono essere integrati con IL-3. Questa citochina induce pDC proliferazione e inibisce la loro apoptosi 16. Tuttavia, IL-3 utilizzo deve essere strettamente controllato in quanto può portare a maturazione pDC o differenziazione. Il metodo qui descritto combina bersaglio da HIV-1 le cellule infettate con PBMC o pDCs appena isolate al fine di ricreare le fasi iniziali coinvolte durante il rilevamento innata. Questo metodo sarà senza dubbio utile per Explore eventi precoci immunitarie innate associate all&#39;infezione da HIV. Anche se i protocolli associati sono finalizzati a misurare tipo I IFN, potrebbero facilmente essere modificati per misurare altre molecole bioattive rilasciate da pDCs al momento della rilevazione delle cellule infette. Questi possono includere: Tipo III-IFN (IFN-λ), citochine pro-infiammatorie (TNF-come α e IL-6) e chemochine CXCL10, CCL4, e CCL5 17.

Tipo I IFN-produzione pDCs rappresentano la prima linea di difesa contro le infezioni virali, e come tale servire come un collegamento vitale tra innata e l&#39;immunità 1. Mentre privi di cellule HIV-1 particelle sono scarsamente riconosciuti dal sistema immunitario innato, cellule T CD4 + HIV-1-infetti siano effettivamente percepite dai pDCs 2. Il meccanismo di rilevamento richiede un contatto iniziale tra la glicoproteina virale (gp120) sulla superficie della cellula infettata T e molecole CD4 sulla pDC, che è poi seguita da cattura virus e internalizzazione dal pDC. Rilevazioni successive di trasferimento di HIV-1 RNA TLR7 determinerà l&#39;attivazione della MyD88 / IRF7 percorso e alla fine conduce al tipo-I produzione di IFN 3. È importante sottolineare che il secondo circuito di sensing presente in pDC, che è mediata da TLR9, è inibita dalla interazione della glicoproteina virale, gp120, con il PDC-specifico marcatore di superficie BDCA2 4. <p class="jove_content"&gt; I TLR7 e TLR9 rilevamento percorsi di pDC possono potenzialmente essere modulata negativamente l&#39;impegno di BST2 (anche designato teterina o CD317) con un altro recettore inibitorio superficie pDC-specifica denominata ILT7 5. BST2 è espresso ad alti livelli in superficie di pDC e alcune cellule tumorali, ma a livelli relativamente bassi in altri tipi di cellule, come le cellule B, macrofagi e cellule T. Importante, BST2 può essere indotta da IFN di tipo I in un certo numero di linee di cellule trasformate e in colture cellulari primarie di origini umane e murine 6. Oltre alla sua funzione immunitaria normativo, BST2 stato recentemente trovato per inibire il rilascio di HIV-1 e altri avvolto particelle virali da particelle virali nascenti reticolazione sulla superficie cellula infetta 7. In caso di HIV-1, la proteina accessoria virus codificato U (Vpu) ha dimostrato di agire come antagonista BST2. Si ritiene che Vpu downregulates BST2 dalla superficie cellulare delle cellule HIV-1-infetti, il sito della sua cavezzazione di attività e di conseguenza aumenta rilascio virale e diffondere 7, anche se questa nozione è stata contestata 8,9. In assenza di Vpu, un gran numero di completamente formati e progenie maturo HIV-1 particelle vengono trattenuti sulla superficie cellulare. Se queste particelle frenati potrebbero rappresentare obiettivi efficaci per il rilevamento immunitario rimane ancora una questione aperta. Inoltre, non è chiaro se Vpu potesse dysregulate tipo I la produzione di IFN da pDCs modulando superficie BST2 livelli. I primi studi disegnati per valutare l&#39;HIV-1 di rilevamento sono stati condotti utilizzando privi di cellule HIV-1 particelle, che sono generalmente considerati poveri induttori di tipo I IFN 3,10-12. Dato che gli studi recenti suggeriscono che PBMCs e pDCs efficiente percepiscono sieropositivo linfociti T CD4 + 2,13,14, descriviamo qui un metodo semplice per misurare le risposte innate innescati da pDCs accreditato in cellule HIV-1-infetti in vitro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="652">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:203px;">MT4 cells</td>
			<td style="width:87px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:103px;">120</td>
			<td style="width:260px;">This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 from Dr. Douglas Richman.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK-Blu IFN-&#945;/&#946; reporter cells </td>
			<td style="width:87px;">Invivogen</td>
			<td style="width:103px;">HKB-IFNAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">RPMI</td>
			<td style="width:87px;">Wisent</td>
			<td style="width:103px;">350-000-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">DMEM</td>
			<td style="width:87px;">Wisent</td>
			<td style="width:103px;">319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">FBS</td>
			<td style="width:87px;">Wisent</td>
			<td style="width:103px;">080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Ficoll-P&#226;que Plus</td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">CD4+ T cell isolation kit II</td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-091-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Diamond Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II </td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-097-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">PHA-L</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">O2769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:203px;">Human rIL-2</td>
			<td style="width:87px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:103px;">136</td>
			<td style="width:260px;">This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: Human rIL-2 from Dr. Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Imiquimod</td>
			<td style="width:87px;">Invivogen</td>
			<td style="width:103px;">TLRL-IMQS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ODN 2216 CpG-A</td>
			<td style="width:87px;">Hycult Biotec</td>
			<td style="width:103px;">HC4037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:203px;">Human IFN&#945;</td>
			<td style="width:87px;">PBL Interferon source</td>
			<td style="width:103px;">11100-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QUANTI-Blue </td>
			<td style="width:87px;">Cedarlane</td>
			<td style="width:103px;">REP-QB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;"> </td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">Flow cytometry (Antibodies/reagents)</td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Fc blocking solution (composition below):</td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td style="width:260px;">Note: make in washing solution (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">10% Goat serum</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">G 9023</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">10% Rabbit serum</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">R 9133</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">10% Mouse serum</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">M 5909</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">2.5 mg/ml human IgG</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">I 4506</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-CD3_Pacific Blue</td>
			<td style="width:87px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">300417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">anti-CD14_PE-TxRed</td>
			<td style="width:87px;">Life Technologie</td>
			<td style="width:103px;">MHCD1417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-BDCA2_APC</td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-090-905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-ILT7_PE</td>
			<td style="width:87px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">326408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-CD4_PerCP/Cy5.5</td>
			<td style="width:87px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">317427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-BST2_Alexa 660</td>
			<td style="width:87px;">eBioscience</td>
			<td style="width:103px;">50-3179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">Paraformaldehyde </td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">P 6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:87px;">BD Falcon </td>
			<td style="width:103px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;"> </td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Equipment</td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Cyan ADP instrument </td>
			<td style="width:87px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:103px;">CY20030</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the innate sensing of hiv-1 infected cd4+ t cells by plasmacytoid dendritic cells using an ex vivo co-culture system.

HIV-1 sensing innata richiede il contatto diretto delle cellule T CD4 + infettate con le cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC). Per studiare questo processo, i protocolli descritti usano appena isolate cellule umane mononucleari di sangue periferico (PBMC) o cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) per rilevare infezioni in entrambe le linee di cellule T (MT4) o di cellule eterologhe primarie T CD4 +. Al fine di garantire un corretto sensing, è essenziale che PBMC sono isolati immediatamente dopo il prelievo del sangue e quella percentuale ottimale di cellule T infettate vengono utilizzati. Inoltre, multi-parametrica citofluorimetrica colorazione può essere utilizzato per confermare che i campioni di PBMC contengono le diverse linee cellulari a rapporti fisiologici. Un certo numero di controlli può anche essere incluso per valutare la vitalità e la funzionalità di pDC. Tra questi, la presenza di marcatori di superficie specifici, valutando le risposte cellulari a agonisti nota di Toll-like receptors (TLR) percorsi, e confermando la mancanza di spontanea tipo I interferone (IFN) di produzione. In questo sistema, PBMC o pDCs appena isolate sono co-coltura con HIV-1 le cellule infettate in 96 pozzetti per 18-22 ore. I surnatanti di questi co-colture sono poi utilizzati per determinare i livelli di IFN di tipo I bioattivi monitorando l&#39;attivazione della via ISGF3 in IFN-alfa cellule / beta HEK-blu. Prima e durante condizioni di co-coltura, le cellule bersaglio possono essere sottoposti ad analisi citofluorimetrica per determinare un numero di parametri, tra cui la percentuale di cellule infettate, i livelli dei marcatori di superficie specifica e differenziale uccisione di cellule infette. Anche se, questi protocolli sono stati inizialmente sviluppati per seguire la produzione di tipo I IFN, che potrebbero essere utilizzati per studiare altre molecole imuno-modulatori rilasciati da pDCs e per ottenere ulteriori informazioni sui meccanismi molecolari che regolano l&#39;HIV-1 sensing innata.

Il sistema di co-coltura descritto nella figura 1 consente uno studio controllato di HIV-1 sensing innata. A causa della natura variabile di pile, è importante che le normali rapporti di cellule mieloidi e T (rispettivamente CD14 + e CD3 +) sono osservati, come nell&#39;esempio mostrato nella Figura 2A. Inoltre, solo un basso numero di cellule T attivate (FS superiori e livelli elevati CD3 rispetto alle cellule non attivati ​​T) sono desiderabili nelle PBMC appena isolate culture. PBMC con rapporti anomale tra i vari tipi di cellule sono spesso incapaci di montare una corretta risposta immunitaria innata in vitro, probabilmente a causa di un fenotipo già attivato a seguito di una infezione in corso. Soprattutto, la percentuale relativa di pDC deve essere valutata come mostrato nella Figura 2B. Sebbene tale percentuale può variare da 0,2 all&#39;1,2%, un rilevamento fenotipo anormale è anche osservata con entrambi extremes di questa gamma. Arricchimento di pDCs usando selezione negativa spesso cede 50-95% pDC di purezza, come si è visto nei due esempi nella Figura 2B (92% e 72%). Un esempio tipico per l&#39;esperimento complessiva è illustrata nelle figure 3 e 4. In questo esempio, le cellule sono state infettate con MT4 pNL4.3-GFP_ires_Nef WT o delta Vpu conseguire infezione 30% al momento della co-coltura (Figura 3A). Come descritto in precedenza, solo le infezioni da virus WT determinato un significativo down-regulation dei BST2 superficie (Figura 3B). A causa delle loro differenze di dimensioni e granularità, cellule MT4 possono essere facilmente distinguibili da PBMC mediante citometria di flusso (figura 4A). Dopo l&#39;incubazione co-coltura, solo PBMC in contatto con noti agonisti TLR7 o TLR9 e PBMC in contatto con l&#39;HIV-1 le cellule infettate rilasciate quantità significative di tipo I IFN (Figura 4B). No IFN è stato rilevato in PBMC da solo, in PBMC co-cultured con cellule MT4 mock-infettate, o solo in cellule MT4 infette (Figura 4B). Nell&#39;esempio qui presentato, rilevamento innata di cellule MT4 HIV-1-infetti da PBMC è risultato essere significativamente ridotta in presenza di Vpu. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1:. Schema di disegno sperimentale SUP: surnatante <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2: caratterizzazione fenotipica di PBMC isolati a fresco e enrpDCs iched. (A) la distribuzione normale di cellule mieloidi e cellule T osservate in PBMC isolati da un donatore sano (percentuale di cellule mieloidi dovrebbero variare tra il 10-20% e le cellule T tra il 55-65%). Campione PBMC erano macchiati con anticorpi coniugati fluoroforo che riconoscono CD14 superficie (marcatore linea mieloide) e CD3 (marker delle cellule T). (B) caratterizzazione fenotipica di pDCs. Prima di pDC arricchimento rappresentano tra 0.2-1.2% del numero totale di cellule nelle PBMC (0,99% nell&#39;esempio illustrato). Queste cellule possono essere identificati sulla base di espressione di marcatori specifici, come BDCA2 e ILT7, presenti sulla superficie cellulare. Selezione negativa può essere utilizzato per arricchire significativamente il numero di pDC ed eliminare contaminazioni potenzialmente dannosi, come CD14 + cellule mieloidi (arricchimento raggiungono il 92% e il 72% nei due esempi illustrati). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig2highres.jpg" target="_blank">Cli</a>ck qui per vedere l&#39;immagine ingrandita. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig3.jpg" width="500px" /> Figura 3:. Caratterizzazione delle cellule MT4 bersaglio HIV-1-infetti (A) Percentuale di cellule infettate nelle culture MT4 infettate con pNL4.3-GFP_ires_Nef WT o dVpu come determinato dalla percentuale di cellule GFP positive. Espressione di superficie (B) delle cellule BST2 nelle cellule infette è stata valutata dopo colorazione della superficie. Gli istogrammi grigi pieni rappresentano cellule mock-infettate macchiate con il siero di coniglio pre-immune (controllo senza macchia); i restanti istogrammi rappresentano cellule colorate con siero policlonale di coniglio anti-BST2. Istogrammi con linee continue rappresentano il controllo negativo GFP (neg) cellule; mentre istogrammi con linee tratteggiate corrispondono a (pos) positivi cellule infette GFP. Influenza mediaintensità orescence valori (MFI) sono indicati per ogni campione. Citometria a flusso è stato eseguito e analizzato come descritto nella Figura 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig4.jpg" width="500px" /> Figura 4:. Cultura Co di PBMC appena isolate e le cellule T infette MT4 (A) Confronto di citometria a flusso profili FS / SS osservati per le cellule T MT4 solo, solo PBMC, o co-colture tra PBMC e cellule MT4 T. A causa delle differenze in termini di dimensioni e granularità, le cellule MT4 T ​​possono essere facilmente distinguibili da PBMC in co-colture in citometria a flusso. (B) Esempio rappresentativo della quantità di tipo I IFN rilasciato dopo stimolazione di PBMC con TLR7 o TLR9 agonisti (fa), o dopo co-culture con finto o le cellule MT4 indicati infettate con pNL4.3-GFP_ires_Nef WT o dVpu. I dati grezzi visualizzati come OD 650 valori e la loro converseion corrispondente per tipo-I concentrazione di IFN espressa in U / ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System. at JoVE.com

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

A differenza privi di cellule HIV-1 particelle, cellule T CD4 + infetti siano effettivamente rilevati dalle cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC). Questo manoscritto descrive un metodo in cui le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) o pDCs isolate sono co-coltura con HIV-1 le cellule T infette di valutare sensing innato da pDCs valutata dal rilascio di tipo I IFN.

Valutare l&#39;innato rilevamento dell&#39;infezione da HIV-1 CD4 infetti<sup&gt; +</sup&gt; Cellule T dalle cellule dendritiche plasmacitoidi Utilizzando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema di co-coltura.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

assessing-innate-sensing-hiv-1-infected-cd4-t-cells-plasmacytoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

8.6K Views.  Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM).  A differenza privi di cellule HIV-1 particelle, cellule T CD4 + infetti siano effettivamente rilevati dalle cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC). Questo manoscritto descrive un metodo in cui le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) o pDCs isolate sono co-coltura con HIV-1 le cellule T infette di valutare sensing innato da pDCs valutata dal rilascio di tipo I IFN. 

Video: Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Preparazione e utilizzo di HIV-1 CD4 infetti primaria + T-Cells come cellule bersaglio nei test di cellule Natural Killer citotossici

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Nuovi strumenti per espandere cellule T regolatorie di individui HIV-1-infetti

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

Valutare lo sviluppo delle cellule murine plasmocitoidi dendritiche in placche del Peyer Utilizzando trasferimento adottivo di ematopoietiche Progenitori

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

Cellule T Capture batteri da Transinfection da cellule dendritiche

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

In Vitro Generazione di Murine plasmacitoidi dendritiche Cellule dal comune linfoide Progenitori utilizzando l&#39;AC-6 Alimentatore Sistema

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&amp;#948;1+CD4+&amp;#947;&amp;#948; T Cells, an Extrathymic &amp;#945;&amp;#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Isolamento e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura di Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; Celle γδ T, un Extrathymic αβT-cellule progenitrici

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Separazione delle cellule fluorescenza-attivato per la purificazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi dal midollo osseo di topo

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Here, we describe a quantitative proteomics method using the technique of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) to analyze the effects of HIV-1 infection on host exosomal proteomes. This protocol can be easily adapted to cells under different stress or infection conditions.

SILAC Based proteomica Caratterizzazione di Esosomi da HIV-1 le cellule infette

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

La differenziazione in vitro di cellule CD4 + umana FOXP3 + indotta da T regolatorie (iTregs) da cellule T CD4 Naïve utilizzando un protocollo TGF-β contenenti

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Sviluppo e validazione di una singola molecola ultrasensibile di matrice digitale analisi enzima-collegata dell'immunosorbente per umana dell'interferone-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...