HIV-1 uncoating studi in laboratorio Aiken sono stati sostenuti da sovvenzioni NIH AI40364, AI50423 e AI076121. Diversi materiali chiave, tra cui i reagenti utilizzati nel p24 ELISA, sono state fornite dal NIH AIDS programma di ricerca e di riferimento, Divisione di AIDS, NIAID, NIH.

1. La produzione di HIV-1 particelle Prima di procedere, è necessario ottenere l&#39;autorizzazione e seguire le indicazioni dall&#39;ufficio biosicurezza del tuo istituto di lavorare in un impianto di biosicurezza approvato per infettivo. È necessario assicurarsi che cura e precauzioni di sicurezza sono seguite durante la lavorazione nel laboratorio di biosicurezza. La produzione di HIV-1 particelle è di solito eseguita da trasfezione transiente di cellule 293T con HIV-1 DNA provirale utilizzando un metodo di fosfato di calcio transfezione 7, 8. Alta riserve di virus titolo cresciuto da colture di cellule T infette sono adatti. <ol><li> Cultura 293T cellule di coltura Dulbecco modificato (DMEM), contenente 10% siero fetale bovino (FBS), integrato con gli antibiotici [penicillina (100 UI / ml) e streptomicina (100 mg / ml)] a 37 ° C, CO 5% 2 . </li><li> Staccare le cellule dai piatti quasi confluenti con 0,25% tripsina-EDTA e semi di 2x10 6 </sfino&gt; cellule in 9 ml per 100 millimetri piatto cultura un giorno prima di trasfezione. 100 semi di sei piatti della cultura mm per la produzione di virioni. Se la preparazione concentrata di core è necessario, più i piatti potevano essere teste di serie per la trasfezione. </li><li> Il giorno dopo, il monostrati cellulari dovrebbero essere circa il 25% confluenti e pronti per la trasfezione. Per sei piatti a base di cellule da transfettate, portare 120 g di DNA provirale fino ad un volume di 2,7 ml con acqua sterile. Per aggiungere questa miscela 0,3 ml di 2,5 M CaCl 2 e 3 ml di 2XBBS, e mescolare correttamente pipettando su e giù diverse volte. Lasciare l&#39;impasto a riposare a temperatura ambiente per 10-20 minuti. </li><li> Aggiungere 1 ml di gocce miscela risultante al centro di ogni piatto, mentre agitando delicatamente per mescolare. Porre le capsule durante la notte (~ 16 ore) in un incubatore a 35 ° C e 3% di CO 2. </li><li> Aspirare il terreno di coltura e delicatamente aggiungere 5 ml di PBS. </li><li> Aspirare il PBS e aggiungere 5 ml di terreno fresco. Coltivare le cellule in incubatore a 37 &amp;deg; C e 5% di CO 2 per ulteriori 24-48 ore. </li><li> Raccogliere il surnatante di coltura contenente particelle virali, trasferirlo in una provetta da centrifuga da 50 ml. Combinare i surnatanti da tutti i piatti e centrifugare a 1500 xg per 5 minuti a pellet di cellule e detriti. Filtrare il surnatante con 0,45 micron pori di dimensioni filtri siringa. Si devono prendere precauzioni per ridurre al minimo la formazione di aerosol durante il lavoro con il virus vivo. Ciò include l&#39;uso di tubi conici con O-ring o coperture rotore durante la fase di centrifugazione. Se ciò non fosse possibile, i tappi a vite dei tubi devono essere confezionate con parafilm. </li></ol> 2. Concentrazione di HIV-1 virioni da ultracentrifugazione <ol><li> Mettere il supernatante della coltura (30 ml) in una provetta per centrifuga polyallomer 38,5 ml (per rotore Beckman SW32Ti o equivalente). Delicatamente alla base il surnatante contenente virus con 5 ml di soluzione di saccarosio al 20% in PBS utilizzando una pipetta da 5 ml. </li><li> Centrifuga per 3 ore a32000 rpm a 4 ° C (175.000 xga r max) a particelle virali pellet. </li><li> Rimuovere il surnatante tramite aspirazione, facendo attenzione a non disturbare il pellet sul fondo della provetta. Aggiungere 0,5 ml di 1XSTE tampone (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) al tubo e posto a 4 ° C per 1 ora per allentare il pellet. Utilizzando un ampio tunnel 1 punta di pipetta ml pipettare delicatamente su e giù per un paio di volte per staccare il pellet dal fondo della provetta. Successivamente, trasferire il pellet sciolto in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml, avendo cura di evitare la formazione di schiuma. Incubare a 4 ° C per un altro 1-3 ore per consentire le macchie di piccoli virus a disperdersi. Durante questo periodo, preparare il gradiente di saccarosio come descritto al punto 3.1. </li><li> Pipettare delicatamente la sospensione dei virus su e giù diverse volte e centrifugare a 8.000 giri (6.000 xg) a 4 ° C in una microcentrifuga refrigerata per 1 minuto per rimuovere macchie residue. Tenere il freddo campione durante questo processo. </li></ol> 3. Gradiente di saccarosiocentrifugazione per isolare nuclei HIV-1 core sono isolati usando un metodo &quot;spin-thru&quot; 9, che è una modifica del metodo precedentemente descritto per la purificazione del virus HIV-2 core 10. <ol><li> Preparare un ml 12 lineare 30% al 70% gradiente di saccarosio in 1XSTE tampone in una provetta da centrifuga da 14,5 ml per polyallomer SW32.1Ti rotore. Per preparare gradiente, utilizzare un gradiente di 20 ml ex; posto 6 ml di soluzione di saccarosio al 70% sul lato vicino (vicino alla porta di uscita) e 6 ml di soluzione di saccarosio al 30% sul lato più lontano. Assicurarsi che le bolle d&#39;aria non sono intrappolate nel canale che collega le due camere. Utilizzare il Densi-Flow gradiente Auto ex di pompare il gradiente dal basso verso l&#39;alto della provetta contenente 1 ml di soluzione di saccarosio 85% sul fondo. Posizionare delicatamente il gradiente a 4 ° C fino raffreddato (2-4 ore). </li><li> Utilizzando un ampio tunnel 1 punta di pipetta ml delicatamente la sovrapposizione sfumatura con 0,25 ml di soluzione di saccarosio al 15% in STE contenente l&#39;1% Triton X-100. </li&gt; <li> Delicatamente sovrapposizione con 0,25 ml di soluzione di saccarosio 7,5% in STE utilizzando un ampio tunnel 1 punta di pipetta ml. Fare attenzione a non mescolare gli strati. </li><li> Delicatamente sovrapposizione con 0,5 ml di sospensione del virus a partire dal punto 2.4. Questa operazione deve essere eseguita con attenzione per evitare qualsiasi disturbo nel gradiente e la miscelazione degli strati saccarosio underlaid. </li><li> Porre i tubi in pre-raffreddata secchio SW32.1Ti e centrifugare a 32.000 rpm (187.000 xga r max) durante la notte (16-20 ore) a 4 ° C. Per evitare la pausa della centrifuga, non iniziare la centrifugazione fino al vuoto nella centrifuga raggiunge i 250 micron </li><li> Raccogliere 1 ml di frazioni da cima a fondo del gradiente utilizzando la funzione Auto-Densi-Flow di frazionamento di un gradiente. Collocare le provette in ghiaccio immediatamente dopo la raccolta. Miscelare il contenuto dei tubi invertendo alcune volte, e prelevare 50 ml di ogni frazione per la quantificazione mediante test ELISA o saggio di attività della trascrittasi inversa. </li></ol> 4. Localizzazione di HIV-1 coree conservazione dei nuclei <ol><li> Prima di eseguire test uncoating, è importante per determinare quali frazioni contengano intatte HIV-1 core. Questo può essere determinato da p24 ELISA o saggio di attività della trascrittasi inversa utilizzando il aliquote di 50 microlitri dal punto 3.6. </li><li> Il recupero di CA associati al core è spesso legata alla stabilità dei nuclei. Misurare il nucleo associato CA p24 ELISA 9 utilizzando un campione da ogni frazione. In alternativa, misurare l&#39;attività della trascrittasi inversa di ogni frazione. Utilizzando entrambi i metodi il picco dovrebbe essere intorno frazione 10. </li><li> In comune le frazioni contenenti i core. Se i core non devono essere utilizzati per uncoating dosaggio immediatamente, un&#39;aliquota i nuclei raggruppati in 0,2-0,3 ml di aliquote, flash-freeze in N2 liquido e conservare a -80 ° C. Nuclei congelati in questo modo sono adatti per l&#39;analisi uncoating. La resa del nucleo-CA è associata in genere 1-2 mg di p24 millilitro o circa il 15% del totale virione associatip24. </li></ol> 5. Analisi cinetica di HIV-1 uncoating <ol><li> La quantità di HIV-1 core richiesto per reazione uncoating è di circa 50 ng. Per eseguire il test in vitro uncoating, Prediluire l&#39;aliquota di nuclei con un uguale volume di freddo 1XSTE tampone per ridurre la viscosità della sospensione e per minimizzare gli errori di pipettamento. </li><li> Diluire ulteriormente 100 l di nuclei in 0,15 ml di tampone 1XSTE freddo contenente 10 mcg / ml di BSA in un tubo da 1,5 ml microcentrifuga. Noi integrare il buffer STE con BSA (10 mcg / ml) per minimizzare l&#39;assorbimento di CA alle pareti del tubo. Miscelare invertendo il tubo parecchie volte. Non vortice dei campioni. Incubare le provette in un bagnomaria a 37 ° C per intervalli di tempo (15, 30, 60 e 120 min). I tubi devono essere immersi in bagno d&#39;acqua almeno fino al livello del campione interna al fine di garantire anche il riscaldamento. </li><li> Durante l&#39;incubazione, delicatamente mescolare il contenuto della provetta periodicamente (di solito 5 -10 min) muovendo il tubo. Per un controllo minuti zero, diluire 100 ml di core in 0,15 ml di tampone 1XSTE freddo e incubare in ghiaccio per tutta la durata dell&#39;esperimento (120 min). Il controllo minuti zero dà il valore basale uncoating e viene utilizzato per determinare aumento uncoating di core incubato a 37 ° C per diversi intervalli di tempo. </li><li> Al termine del periodo di incubazione, arrestare il processo di uncoating mettendo le provette in ghiaccio per 10 minuti. </li><li> Centrifugare le provette a 45.000 rpm (TLA-55 rotore; 125.000 xga r max) per 20 minuti a 4 ° C. Questo pellet i nuclei intatti e il libero CA rilasciato a seguito di uncoating di core rimane nel surnatante. Il rotore deve essere preraffreddato a 4 ° C prima di caricare i campioni. </li><li> Trasferire il surnatante a nuovi tubi microcentrifuga preraffreddato preferibilmente usando gel-loading punte conservato a temperatura ambiente. Si prega di notare che il pellet non sarà visibile a occhio nudo, in modo da prendere estrema cura wentre pipettaggio il surnatante. Risospendere il pellet in 250 ml di diluente per campioni ELISA (0,5% Triton X-100 e il 5% dei donatori di siero di vitello in PBS). Per garantire un efficiente scioglimento del pellet, vortice dopo aver aggiunto il diluente per campioni ELISA. Quantificare il contenuto CA del pellet e surnatante utilizzando p24 ELISA, come descritto nella sezione seguente. </li><li> Il grado di uncoating si ottiene calcolando la frazione di CA presenti nel surnatante. </li></ol> 6. Test per CA da p24 ELISA <ol><li> Molti kit commerciali ELISA sono disponibili e possono essere utilizzati per quantificare CA. Utilizzare qualsiasi commerciale o &quot;in-house&quot; ELISA e includere norme p24 per determinare la linearità del test. Diluizioni dei campioni devono essere analizzati per accertare l&#39;esattezza. </li><li> Abbiamo sviluppato una casalinga ELISA che usano abitualmente per test di CA. La procedura è adattato da una precedente relazione 11 e viene eseguita utilizzando anticorpi di cattura e rivelatore disponibile presso AID NIHS ricerca e reagente Reference Program. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: Un esempio di risultato da ELISA per la determinazione frazioni contenenti core è mostrata in Figura 1. Dopo aver raccolto frazioni (1 ml ciascuna), 50 ml di campione da ogni frazione è stato usato per fare diluizioni seriali e analizzati con il metodo ELISA. La p24 totale ottenuto sommando i valori per dodici frazioni è stata del 14,5 mcg. Come mostrato nelle frazioni figura 8-10 core contenuti. Il valore di p24 per il nucleo contenente frazioni era 2,17 mg. La percentuale di core-associati p24 (14.97%) è stato determinato sulla base del rapporto di valore p24 per le frazioni principali (2,17 mg) per il valore totale p24 (14,5 mg). Frazione 1 o 2 conterrà sempre più alta quantità di p24, che rappresenta CA libero che non è associato con i core. Questa è seguita da una graduale riduzione nei valori di p24 con ogni frazione successiva, poi un forte aumento e, infine, un forte calo nel p24valori. Se ci si prenda cura durante il caricamento del gradiente poi il picco di core-associata CA si trova attorno frazione 10. Un tipico risultato ottenuto testando la cinetica di uncoating di HIV-1 core è mostrato in Figura 2. Il grafico mostra un tempo-dipendente aumento uncoating di tipo selvaggio di HIV-1 core. La percentuale uncoating valore è stato ottenuto calcolando la frazione di CA presente nel surnatante. Con la pratica, l&#39;analisi è altamente riproducibile ed è utile per determinare la stabilità del core virale in vitro. Si prega di notare che la riproducibilità del dosaggio è fortemente dipendente dalla corretta gestione dei campioni durante la procedura. Dal momento che i nuclei sono termolabile, i campioni devono essere mantenuti a 4 ° C durante tutta la seduta tranne durante il periodo di incubazione. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3384/3384fig1.jpg" /> Figura 1 Densità di centrifugazione in gradiente di equilibrioHIV-1 core. Una sospensione di virus concentrati è stato applicato alla parte superiore di una pendenza del 30 al 70% di saccarosio lineari sovrapposti con 1% Triton X-100. A seguito di centrifugazione notte a 187.000 xg e 4 ° C, 1 ml di frazioni sono stati raccolti da cima (Frazione 1) al basso (Frazione 12) e p24 è stata quantificata mediante ELISA. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3384/3384fig2.jpg" /> Figura 2 Tempo corso di HIV-1 uncoating in vitro. Purificato da HIV-1 core sono stati diluiti e incubato a 37 ° C per gli intervalli di tempo indicato. Il campione minimo pari a zero è stato incubato in ghiaccio per tutta la durata dell&#39;esperimento. Dopo l&#39;incubazione, i campioni sono stati ultracentrifugati a 125.000 xg per 20 minuti a 4 ° C. Surnatante e pellet sono stati separati e analizzati da p24 ELISA. L&#39;entità della uncoating è stato determinato come descritto nel testo del protocollo. Ogni reazione uncoating è stata effettuata in duplicato, le barre di errore coprono la gamma dei due valori.

<ol>
	<li>Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+analysis+of+conical+models+for+the+HIV-1+core.">Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core.</a> Science. 283, 80-83 (1999).</li><li>Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+reconstructions+of+helical+assemblies+of+the+HIV-1+CA+protein.">Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein.</a> Nature. 407, 409-413 (2000).</li><li>Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+and+cellular+factors+that+regulate+HIV-1+uncoating.">Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating.</a> Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).</li><li>Forshey, B. M., Schwedler, U. v. o. n., Sundquist, W. I., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+human+immunodeficiency+virus+type+1+core+of+optimal+stability+is+crucial+for+viral+replication.">Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication.</a> J. Virol. 76, 5667-5677 (2002).</li><li>Forshey, B. M., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disassembly+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cores+in+vitro+reveals+association+of+Nef+with+the+subviral+ribonucleoprotein+complex.">Disassembly of human immunodeficiency virus type 1 cores in vitro reveals association of Nef with the subviral ribonucleoprotein complex.</a> J. Virol. 77, 4409-4414 (2003).</li><li>Wacharapornin, P., Lauhakirti, D., Auewarakul, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+capsid+mutations+on+HIV-1+uncoating.">The effect of capsid mutations on HIV-1 uncoating.</a> Virology. 358, 48-54 (2007).</li><li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA.">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).</li><li>Aiken, C., Prasad, V. R., Ganjam, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Molecular Biology. 485, 41-53 (2009).</li><li>Kotov, A., Zhou, J., Flicker, P., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Nef+with+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+core.">Association of Nef with the human immunodeficiency virus type 1 core.</a> J. Virol. 73, 8824-8830 (1999).</li><li>Kewalramani, V. N., Emerman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vpx+association+with+mature+core+structures+of+HIV-2.">Vpx association with mature core structures of HIV-2.</a> Virology. 218, 159-168 (1996).</li><li>Wehrly, K., Chesebro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p24+antigen+capture+assay+for+quantification+of+human+immunodeficiency+virus+using+readily+available+inexpensive+reagents.">p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents.</a> Methods. 12, 288-293 (1997).</li><li>Welker, R., Hohenberg, H., Tessmer, U., Huckhagel, C., Kr&#228;usslich, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+structural+analysis+of+isolated+mature+cores+of+human+immunodeficiency+virus+type+1.">Biochemical and structural analysis of isolated mature cores of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 74, 1168-1177 (2000).</li><li>Briggs, J. A., Wilk, T., Welker, R., Kr&#228;usslich, H. G., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organization+of+authentic,+mature+HIV-1+virions+and+cores.">Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores.</a> EMBO J. 22, 1707-1715 (2003).</li><li>Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., Puthavathana, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoating+of+HIV-1+requires+cellular+activation.">Uncoating of HIV-1 requires cellular activation.</a> Virology. 337, 93-101 (2005).</li><li>Accola, M. A., Ohagen, A., G&#246;ttlinger, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cores:+retention+of+Vpr+in+the+absence+of+p6(gag.">Isolation of human immunodeficiency virus type 1 cores: retention of Vpr in the absence of p6(gag.</a> J. Virol. 74, 6198-6202 (2000).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo qui descritto per purificare l&#39;HIV-1 core per studiare uncoating in vitro è utile per lo studio di questa fase del ciclo di HIV-1 vita, soprattutto a causa di indisponibilità di un metodo convalidato di analisi uncoating HIV-1 nelle cellule bersaglio. Anche se questo metodo utilizza ultracentrifugazione equilibrio per purificare core, altri ricercatori hanno utilizzato pellettizzazione diretta dopo breve lisi con 1% Triton X-100-12, 13 o cubettatura attraverso un cuscino di saccarosio sovrappo...

<table border="1"><tbody><tr><td width="190"> Nome del reagente </td><td width="197"> Azienda </td><td width="114"> Numero di catalogo </td><td width="161"> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Mallinckrodt Baker Inc </td><td> 9002-93-1 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Acros </td><td> 9005-64-5 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% tripsina-EDTA </td><td> Cellgro </td><td> 25-053-CI </td><td></td></tr><tr><td> 2XBBS </td><td></td><td></td><td> Composizione: 50 mM BES [p H 6,95], 280 mM NaCl e 1,5 mM Na 2 HPO 4. Portare il pH a 6,95a temperatura ambiente. Filtro sterilizzare e conservare in aliquote a -20 ° C. </td></tr><tr><td> Rivestimento di anticorpi: anticorpi monoclonali per p24 (183-H12-5C) </td><td> NIH AIDS programma di ricerca e reagente di riferimento </td><td> 3537 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpi primari: l&#39;HIV-Ig (iperimmuni siero del paziente umano) </td><td> NIH AIDS Research Programma di riferimento e dei reagenti </td><td> 3957 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpo secondario: Capra anti-IgG umane, coniugati con perossidasi </td><td> Perforare </td><td> 31130 </td><td></td></tr><tr><td> HRP substrato </td><td> KPL Inc </td><td> 50-76-11 </td><td></td></tr><tr><td> Immulon 2HB Piastre a 96 pozzetti </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3455 </td><td></td></tr><tr><td> SW32Ti e SW32.1 rotori Ti e ultracentrifuga compatibile </td> &lt;td&gt; Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TLA-55 rotore e ultracentrifuga da tavolo </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Alta velocità di provette per microcentrifuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> 326823, 358123, 357448 </td><td></td></tr><tr><td> Auto-Densi di frazionamento di un gradiente di densità di flusso </td><td> Labconco Corp. </td><td> 4517000 </td><td></td></tr><tr><td> Gradiente Ex </td><td> CBS Scientific Co. Inc. </td><td> GM-20 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro uncoating of hiv-1 cores

Il genoma dei retrovirus è racchiuso in un capside circondato da un involucro lipidico. Per i lentivirus, come l&#39;HIV-1, la conchiglia conica capside è composto di proteine ​​CA disposti come un reticolo di esagono. Il capside è chiuso da 7 pentameri alla fine ampio e 5 alla parte più stretta del cono 1, 2. Racchiuso in questa shell capside è il complesso ribonucleoproteina virale, e insieme costituiscono il nucleo. In seguito alla fusione della membrana virale con la membrana della cellula bersaglio, di HIV-1 è rilasciata nel citoplasma. Il capside poi smonta il rilascio gratuito CA in forma solubile 3 in un processo denominato uncoating. La posizione intracellulare e la tempistica di HIV-1 uncoating sono poco conosciuti. Singolo aminoacido sostituzioni in CA che alterano la stabilità del capside anche compromettere la capacità del virus HIV-1 di infettare le cellule 4. Ciò indica che la stabilità del capside è fondamentale per HIV-1. </p&gt; HIV-1 uncoating è stata difficile da studiare a causa della mancanza di disponibilità di test sensibile e affidabile per questo processo. Qui si descrive un metodo quantitativo per lo studio in vitro utilizzando uncoating nuclei isolati da infezioni HIV-1 particelle. L&#39;approccio prevede l&#39;isolamento dei nuclei per sedimentazione di virioni concentrati attraverso uno strato di detergente e in un gradiente di saccarosio lineare, al freddo. Per quantificare uncoating, i nuclei isolati sono incubati a 37 ° C per diversi intervalli di tempo e poi pellet da ultracentrifugazione. Il grado di uncoating è analizzato da quantificare la frazione di CA nel surnatante. Questo approccio è stato impiegato per analizzare gli effetti delle mutazioni virale HIV-1 la stabilità del capside 4, 5, 6. Dovrebbe anche essere utile per studiare il ruolo dei fattori cellulari di HIV-1 uncoating.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Uncoating of HIV-1 Cores at JoVE.com

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating è un passo essenziale nella fase iniziale del ciclo di vita di HIV-1 ed è definito come lo smontaggio del guscio capside e il rilascio del complesso ribonucleoproteina virale (vRNP). In questo studio dimostriamo tecniche per isolare nuclei intatti da HIV-1 virioni e per quantificare la loro uncoating<em&gt; In vitro</em&gt;.

In uncoating vitro di HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

15.6K Views.  Vanderbilt University School of Medicine. Uncoating è un passo essenziale nella fase iniziale del ciclo di vita di HIV-1 ed è definito come lo smontaggio del guscio capside e il rilascio del complesso ribonucleoproteina virale (vRNP). In questo studio dimostriamo tecniche per isolare nuclei intatti da HIV-1 virioni e per quantificare la loro uncoating In vitro.

Video: In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inferenza genotipica del virus HIV-1 Tropismo utilizzo basati sulla popolazione sequenziamento del V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

Pronostico di HIV-1 Uso corecettore (tropismo) mediante analisi della sequenza utilizzando un approccio genotipica

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

Imaging di HIV-1 Envelope indotta Synapse virologica e segnalazione sui doppi strati lipidici sintetici

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infezione da modello per lo studio<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 in Interazioni umane Le cellule immunitarie primarie derivate da monociti

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target conserved portions of the HIV-1 genome that escape with difficulty. Sequence changes attributed to cellular immune pressure arise across the genome during infection, and if found within conserved regions of the genome such as Gag, can affect the ability of the virus to replicate in vitro. Transmission of HLA-linked polymorphisms in Gag to HLA-mismatched recipients has been associated with reduced set point viral loads. We hypothesized this may be due to a reduced replication capacity of the virus. Here we present a novel method for assessing the in vitro replication of HIV-1 as influenced by the gag gene isolated from acute time points from subtype C infected Zambians. This method uses restriction enzyme based cloning to insert the gag gene into a common subtype C HIV-1 proviral backbone, MJ4. This makes it more appropriate to the study of subtype C sequences than previous recombination based methods that have assessed the in vitro replication of chronically derived gag-pro sequences. Nevertheless, the protocol could be readily modified for studies of viruses from other subtypes. Moreover, this protocol details a robust and reproducible method for assessing the replication capacity of the Gag-MJ4 chimeric viruses on a CEM-based T cell line. This method was utilized for the study of Gag-MJ4 chimeric viruses derived from 149 subtype C acutely infected Zambians, and has allowed for the identification of residues in Gag that affect replication. More importantly, the implementation of this technique has facilitated a deeper understanding of how viral replication defines parameters of early HIV-1 pathogenesis such as set point viral load and longitudinal CD4+ T cell decline.

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

HIV-1 pathogenesis is defined by both viral characteristics and host genetic factors. Here we describe a robust method that allows for reproducible measurements to assess the impact of the gag gene sequence variation on the in vitro replication capacity of the virus.

Un enzima di restrizione metodo basato clonazione per valutare l&#39;<em&gt; In vitro</em&gt; Replica Capacità di HIV-1 Sottotipo C Gag-MJ4 chimerici virus

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Valutazione conformazionale di HIV-1 trimeric busta glicoproteine ​​Utilizzando una base di Cell-ELISA Saggio

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Isolamento di esosomi dal plasma di HIV-1 individui positivi

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Valutazione della efficacia e la tossicità degli RNA targeting HIV-1 Produzione per l&#39;uso in gene terapia farmacologica

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.

Migrazione phagosome e velocità misurata in Live primarie macrofagi umani infettati con HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Misurazione<em&gt; In Vitro</em&gt; Integrazione di attività del virus HIV-1 preintegrazione Complessi

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...