Questo protocollo fornisce l'analisi in tempo reale di due principali vie bioenergetiche: la respirazione mitocondriale e la glicolisi in tessuti retinici di topo ex vivo appena sezionati. L'analisi tradizionale del cavalluccio marino si è concentrata sulle cellule monostrato in coltura, mentre questo protocollo consente ai ricercatori di studiare l'attività mitocondriale nei tessuti appena sezionati, in particolare la retina. Questa tecnica viene utilizzata per studiare le attività dei mitocondri e le bandiere di glicolisi nelle retine di modelli murini di degenerazione retinica ereditaria.
È uno strumento utile per la ricerca retinica e ha anche il potenziale per essere applicato ad altri tipi di tessuto per sviluppare potenziali terapie. La parte più difficile di questo protocollo è ottenere dischi di punch di qualità dalla retina del topo appena sezionata, quindi si raccomanda che l'individuo che eseguirà questa tecnica abbia buone capacità di dissezione retinica. Il giorno prima dell'esperimento, aprire la cassetta della cartuccia del sensore e aggiungere un millilitro di mezzo di calibrazione a ciascun pozzetto della piastra di utilità.
Incubare durante la notte in un incubatore privo di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per attivare i fluorofori. Il giorno dell'esperimento, preparare il mezzo di saggio in farmaci composti diluiti da stock. Riscaldare il mezzo di analisi nel bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.
Impostare il programma di analisi sulla macchina come descritto nel manoscritto di testo. Aprire il coperchio della cassetta contenente inserti a rete. Pipettare otto microlitri della miscela di rivestimento per ogni inserto a rete, quindi utilizzare una punta di pipetta per distribuire delicatamente la goccia intorno per distribuire equamente la miscela di rivestimento in tutto l'inserto a rete.
Chiudere la cassetta e lasciare incubare gli inserti in rete a temperatura ambiente per almeno 25 minuti per l'assorbimento. Dopo l'incubazione, lavare gli inserti a rete pipettando quattro millilitri del mezzo di saggio direttamente sugli inserti. Agitare delicatamente la cassetta per assicurarsi che tutti gli inserti in rete vengano lavati con il mezzo di analisi.
Per preparare il punch retinico, enucleare gli occhi da un topo adulto eutanasizzato e metterli in PBS ghiacciato in una capsula di Petri, quindi posizionare la capsula di Petri sotto un microscopio di dissezione. Utilizzando microscissori, tagliare il nervo ottico, quindi rimuovere con cura i muscoli extraretti attaccati all'esterno del bulbo oculare. Usando un ago calibro 30, perforare un foro sul bordo della cornea.
Quindi utilizzare microscissori di dissezione fine per effettuare un taglio circolare lungo il bordo della cornea. Usando una pinza di dissezione affilata, rimuovere la cornea, la lente e l'umore vitreo dalla coppa dell'occhio. Fare diversi piccoli tagli sullo strato sclerale sul bordo della coppa dell'occhio usando microscissori di dissezione fine.
Utilizzare due pinze di dissezione affilate per trattenere il tessuto sclerale su ciascun lato e tirare lo strato sclerale con molta attenzione per rimuoverlo dalla retina neurale. Ripeti questo intorno alla coppa dell'occhio fino a quando tutta la sclera viene rimossa e si ottiene una coppa retinica intatta. Effettuare tagli radiali sulla tazza retinica per appiattirla e generare diverse sezioni distinte utilizzando microscissori di dissezione.
Successivamente, utilizzando un punzonatore per biopsia di un millimetro di diametro, tagliare un disco retinico da ciascuna sezione della tazza retinica appiattita. Punzonatura a una distanza uguale dalla testa del nervo ottico. Trasferire gli inserti in rete preverniciati nella piastra di Petri di dissezione usando una pinza.
Con l'aiuto di due pennelli per ciglia super fini, posizionare il disco di punzonatura retinica al centro dell'inserto a rete con lo strato di cellule gangliari lato verso il basso toccando la rete e lo strato di fotorecettore rivolto verso l'alto. Per caricare la cartuccia del sensore, estrarre la cassetta della cartuccia del sensore idratata dall'incubatore a 37 gradi Celsius. Dopo aver rimosso il coperchio dell'idro booster, riposizionare la cartuccia del sensore sulla piastra di utilità.
Caricare il volume desiderato di soluzioni composte di iniezione nelle porte appropriate tenendo la punta della pipetta con un angolo di 45 gradi, inserendo la punta della pipetta a metà strada in una porta di iniezione con la smussatura della punta contro la parete opposta della porta di iniezione. Caricare delicatamente il composto in ogni porta. Caricare la cartuccia del sensore nella macchina per la calibrazione facendo clic sul pulsante Avvia esecuzione per aprire il vassoio della macchina.
Inserire la cartuccia del sensore nella macchina e fare clic sul pulsante Sono pronto per avviare la calibrazione. Caricare il volume desiderato del mezzo di analisi in ciascun pozzetto della piastra di cattura dell'isolotto. Usando la pinza, afferrare il bordo dell'inserto a rete contenente dischi di punzonatura retinica ed estrarlo dalla capsula di Petri.
Picchiettare leggermente il fondo dell'inserto a rete su un tessuto assorbente per rimuovere il liquido extra e metterlo nel pozzetto della piastra di cattura dell'isolotto. Ripetere questo passaggio fino a quando tutti gli inserti mesh con punzoni retinici vengono inseriti nella piastra di cattura dell'isolotto riempiendo i pozzetti di correzione dello sfondo e i pozzetti vuoti con inserti a rete vuoti. Utilizzando due pinze Graefe, premere il bordo di ciascun inserto a rete con attenzione e delicatezza, assicurandosi che questi siano inseriti saldamente nella parte inferiore della piastra di cattura dell'isolotto.
Posizionare la piastra di cattura dell'isolotto caricata in un incubatore a 37 gradi Celsius per cinque minuti per riscaldarsi, quindi espellere la piastra di utilità al termine della calibrazione. Sostituirlo con la piastra di cattura dell'isolotto contenente punzoni retinici e riprendere l'esecuzione del test facendo clic sul pulsante della piastra della cella di carico. Al termine dell'esecuzione, espellere la cartuccia del sensore e la piastra di acquisizione dell'isolotto contenente punzoni retinici facendo clic sul pulsante di espulsione, quindi fare clic sul pulsante Fatto in modo che i dati vengano salvati automaticamente come file ASYR e lo schermo cambi automaticamente per visualizzare i risultati.
Il test dello stress mitocondriale che mostra una traccia OCR e un test della velocità glicolitica che mostra sia la traccia OCR che la traccia ECAR sono stati eseguiti utilizzando dischi perforati retinici da un millimetro appena sezionati. Nel test dello stress mitocondriale, Bam15 è stato iniettato per disaccoppiare il gradiente protonico dalla produzione di ATP mitocondriale, con conseguente aumento dell'OCR al massimo livello. Rotenone e antimicina A sono stati iniettati per inibire la respirazione dei mitocondri rispettivamente nel complesso uno e nel complesso tre, con conseguente calo dell'OCR al livello minimo.
La differenza tra il livello massimo di OCR e l'ultima misurazione del livello di OCR basale riflette la capacità di riserva mitocondriale. Nel test della velocità glicolitica, l'iniezione di rotenone e antimicina A arresta la respirazione mitocondriale e spinge la glicolisi più in alto. La glicolisi viene colta iniettando 2-deossi-d-glucosio, che compete con il glucosio per il legame con l'esochinasi, causando la caduta dell'ECAR al livello minimo.
La differenza tra il livello massimo di glico ECAR nell'ultima misura del livello basale di glico ECAR riflette la capacità di riserva di glicolisi. Per produrre dati affidabili, è fondamentale ottenere una buona qualità dei dischi di punzonatura retinica e limitare il tempo totale di dissezione entro 1,5 ore. Seguendo l'esperimento, si può quantificare il DNA del contenuto proteico di un disco retinico in un pozzo e usarlo per normalizzare i dati del cavalluccio marino.
Quindi questo protocollo è stato utilizzato per studiare lo sviluppo, l'invecchiamento e la malattia nella retina. È stata anche analizzata la preferenza tissutale o la dipendenza da diversi substrati di carburante come glucosio o acidi grassi.
