L'area è considerata di interesse per le colture 3D di cellule staminali pluripotenti umane a causa del miglioramento della pluripotenza e del potenziale di differenziazione che questa cultura ha formato. Abbiamo descritto la nostra strategia di incapsulamento che porta alla formazione riproducibile di sferoidi di cellule staminali pluripotenti umane. Una volta incapsulati, questi sferoidi di cellule staminali sono suscettibili di coltivazione, sia in piastre multi-pozzo che in bioreattori mescolati.
La nostra strategia di incapsulamento è ottimizzare la capacità di sopravvivenza della pestilenza e l'alta efficienza della formazione di sferoidi. Gli sferoidi incapsulati sono protetti contro il taglio o l'energia meccanica associata all'agitazione o al dondolo. Lo sviluppo di cellule staminali derivate dalla terapia cellulare dipende in parte dalla capacità di generare il prodotto cellulare desiderato in modo scalabile, efficiente ed economico.
La tecnologia di incapsulamento qui descritta rappresenta un passo in questa direzione. La tecnologia di incapsulamento qui descritta sarà probabilmente applicabile alla coltivazione 3D di vari tipi di cellule da altre cellule ad altre cellule staminali pluripotenti. Iniziare preparando 30 millilitri di soluzione madre due volte core mescolando 4,8 grammi di 35 kilodalton PEG, 10,2 millilitri di fluidi gradienti di densità e 19,8 millilitri di supporti DMEM/F-12.
Quindi filtrare questa soluzione di base utilizzando un filtro a siringa da 0,22 micrometri. Quindi, preparare 50 millilitri di olio minerale con tensioattivo al 3% mescolando 48,5 millilitri di olio minerale e 1,5 millilitri di tensioattivo. Quindi sterilizzare la soluzione facendola passare attraverso un filtro a siringa da 0,22 micrometri.
Quindi, preparare 1 DTT molare, 1 TEA molare e 1% di soluzioni PF127, come descritto nel manoscritto di testo. Quindi preparare un'emulsione reticolante mescolando 4,5 millilitri di olio minerale con tensioattivo al 3% e 300 microlitri di 1 DTT molare. Dopo aver vorticoso la soluzione per due minuti, sonicare per 45-60 minuti in un bagno ad ultrasuoni a 20 gradi Celsius e caricarla su una siringa da 5 millilitri con un ago calibro 27.
Quindi, preparare la soluzione di olio schermante caricando l'olio minerale con tensioattivo allo 0,5% in una siringa da 5 millilitri con un ago calibro 27. Per preparare la soluzione di guscio, aggiungere 32 milligrammi di peg4 maleimide in 400 microlitri di DPBS. Quindi, aggiungere 6 microlitri di 1 TEA molare.
Vortice la soluzione per 2 minuti e centrifugandola attraverso un filtro di centrifuga. Tenere la soluzione al buio sul bilanciere per 30 minuti prima di caricarla in una siringa da 1 millilitro con un ago calibro 27. Infine, preparare la soluzione di base finale sospendendo nuovamente 20 milioni di hPSC in 200 microlitri e mescolare con 30 microlitri dell'1% PF127 e 200 microlitri di soluzione core 2X.
Inserire una piccola barra agitatrice in una siringa da 1 millilitro. Quindi, caricare la soluzione di nucleo contenente la cella nella siringa con un ago calibro 27. Iniziare posizionando il dispositivo a goccia PDMS incollato, 4 pezzi di 20 centimetri di lunghezza e 1 pezzo di microtubi di ingresso lunghi 5 centimetri, 1 pezzo di tubo di uscita da 10 centimetri e 6 pezzi di tubi di montaggio da 0,5 centimetri sotto la sorgente luminosa germicida per 30 minuti per la sterilizzazione.
Ora inserisci i 4 pezzi di microtubi di ingresso lunghi 20 centimetri nel guscio, nell'olio, nell'emulsione reticolante e nelle prese d'ingresso del dispositivo di dissociazione usando una pinza. Quindi, inserire l'estremità opposta dei tubi nell'ago della siringa con la soluzione corrispondente. Nel frattempo, collegare l'ingresso principale dei dispositivi microfluidici e l'uscita dei dispositivi di dissociazione con un microtubo di 5 centimetri.
Inserire 1 tubo di uscita nella porta di uscita fluidica e posizionare l'estremità opposta in un serbatoio di raccolta. Quindi, posizionare il dispositivo su uno stadio del microscopio e collegare il tubo per evitare qualsiasi movimento. Allineare e focalizzare il microscopio sull'ugello del dispositivo per l'ispezione del flusso.
Posizionare ogni siringa su diverse pompe a siringa e fissarla correttamente. Programmare ogni pompa secondo i protocolli del produttore alle portate menzionate nel manoscritto di testo e avviare il flusso in tutte le pompe. Attendere che ogni fluido entri nel dispositivo e riempire i canali mentre si spinge fuori l'aria rimanente.
Quando la formazione della capsula è stabilizzata, posizionare l'estremità opposta del tubo di raccolta in un nuovo tubo conico contenente 5 millilitri di mezzi mTeSR. Una volta raccolte abbastanza capsule, incubarle per 10 minuti. Le capsule che risiedono nella fase oleosa saranno nella parte superiore del tubo, che si deposita sul fondo dopo aver toccato delicatamente il tubo.
Per recuperare le capsule, iniziare rimuovendo l'olio dal tubo di raccolta. Quindi, posizionare le capsule su un filtro cellulare di dimensioni dei pori di 100 micrometri e lavare il filtro con abbondanti quantità di mezzi. Invertire il filtro sopra un pozzetto di una piastra di coltura a 6 pozzetti e raccogliere le microcapsule facendo passare 2 millilitri di terreno attraverso il filtro.
Incubare le capsule di cellule staminali in un piatto di coltura a 6 pozzetti a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Cambiare i supporti a giorni alterni raccogliendo le capsule su un filtro filtrante cellulare, lavandole con i mezzi in eccesso e sospendendole nuovamente in un nuovo pozzo in piastre a 6 pozzetti con mezzi da 2 millilitri. Eseguire il test di vitalità aggiungendo 4 microlitri dei 2 micromolari Ethidium Homodimer-1 e 1 microlitro delle 4 soluzioni micromolari di Calcein-AM a 2 millilitri di DPBS sterile.
Vortice per garantire la miscelazione completa. Raccogliere circa 100 microcapsule su un filtro cellulare e risciacquarle con DPBS sterile per consentire la diffusione del mezzo dalle capsule. Raccoglierli nuovamente in una piastra di coltura a 12 pozzetti usando 1 millilitro della soluzione preparata contenente Ethidium Homodimer-1 e calceina AM e incubare a 37 gradi Celsius per 20 minuti.
Visualizza le cellule al microscopio a fluorescenza. Le microcapsule ottimali e subottimali fabbricate utilizzando la generazione di goccioline microfluidiche hanno mostrato differenze nella morfologia della capsula in funzione del contenuto di PEG4-Maleimide nel guscio. Le capsule lisce con bordi luminosi sono associate all'integrità meccanica desiderata.
L'aggregazione di perline al centro delle capsule indica che il nucleo era acquoso e le perline erano libere di muoversi. L'anulus fluorescente indicava la presenza di un guscio di idrogel ed era usato per determinare lo spessore del guscio. Le macchie vive o morte 6 ore dopo l'incapsulamento delle cellule H9 hanno dimostrato che le cellule hanno raggiunto una vitalità superiore al 95% durante le corse di incapsulamento.
Confrontando il tasso di crescita e il potenziale di differenziazione degli sferoidi incapsulati rispetto a quelli non incapsulati. È stato determinato che il processo di incapsulamento non ha effetti negativi sulle hPSC. Ricorda che è importante stabilire un rapporto di portata ottimale tra il guscio centrale e i flussi di olio.
Non farlo può causare capsule che non saranno meccanicamente forti e potrebbero rompersi durante la manipolazione. Vorremmo sottolineare che questa tecnica di incapsulamento era per tipi di cellule diversi dalle cellule staminali pluripotenti umane. Abbiamo incapsulato, principalmente ipotizzato, linee cellulari tumorali e cellule staminali mesenchimali utilizzando una strategia simile.
Attualmente, il nostro team sta sviluppando la prossima generazione di microcapture. Queste microcatture sono bioattive e possono essere caricate con fattori incrociati per la differenziazione incapsulata delle cellule staminali.
