La spettroscopia di correlazione incrociata a fluorescenza è un metodo statistico che utilizza la fluorescenza del risultato temporale per individuare la firma dinamica dei recettori accoppiati alla proteina G nelle cellule viventi. Qui, siamo particolarmente interessati, ai recettori adrenergici beta-2. I recettori sfingolipidici forniscono principalmente informazioni sulla dinamica di diffusione traslazionale e con l'aiuto dell'anisotropia a fluorescenza anche sulla diffusione rotazionale.
Introducendo un'etichetta aggiuntiva, possiamo anche pro-binding o addirittura modifiche conformazionali se promuovono il trasferimento di energia di risonanza tra le etichette come sondato. La fluorescenza quantitativa risolta nel tempo richiede un attento allineamento delle misure di configurazione e calibrazione. Nei minuti seguenti, forniremo una guida sperimentale per la spettroscopia di correlazione di fluorescenza delle cellule di vita, la spettroscopia di correlazione incrociata e il trasferimento di energia di risonanza Forster di recettori accoppiati a proteine G, utilizzando tag clonabile e forza di flusso sintetica.
La seduta cellulare e il trasfisso devono essere eseguiti in condizioni sterili. Posizionare un bilanciere di copertura pulito su una piastra di coltura a sei pozzetti e lavarlo con soluzione salina tampone fosfato sterile aggiungere due ml di terreno di coltura cellulare con rosso fenolo integrato con siero bovino fetale al 10%, 100 microgrammi, penicillina amminica e 100 microgrammi per ml di streptomicina a ciascun pozzetto e tenerlo da parte. Prendi le cellule CHO che vengono coltivate nello stesso mezzo con rosso fenolo a 37 gradi centigradi nel cinque percento di CO2 e lavale con cinque ml di PBS per rimuovere le cellule morte.
Aggiungere due ml di tripsina e incubare per due minuti a temperatura ambiente. Diluire le cellule di dati con otto ml di mezzo con rosso fenolo e mescolare accuratamente mediante pipettaggio. Contare le cellule in una camera Neubauer e far sedere le cellule ad una densità di 150.000 cellule per pozzetto nella piastra di coltura a sei pozzi contenente lo slittamento di copertura.
Lasciare che le cellule crescano in un'incubatrice per 24 ore al fine di ottenere una confluenza approssimativa dell'80%. Diluire due microgrammi del DNA vettore desiderato. Ad esempio, CT SNAP o NT SNAP e sei microlitro di quel reagente di trasfezione in due tubi separati.
Ciascuno contenente 500 microlitro ridotto mezzo sierico per ogni pozzo e incubarli per cinque minuti a temperatura ambiente. Mescolare le due soluzioni insieme per ottenere la miscela di trasfezione e incubarla per altri 20 minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, lavare le cellule CHO sedute una volta con PBS sterile.
Sostituire il PBS con un ml per pozzedo di mezzo libero dal rosso fenolo, integrato con siero bovino fetale al 10% e senza antibiotici. Aggiungere l'intera miscela di costruzione di un ml di goccia per ogni pozzo e incubare le cellule durante la notte a 37 gradi nel cinque percento di CO2. Per l'etichettatura, diluire il substrato SNAP appropriato in un mezzo mL integrato con siero bovino fetale al 10% per ottenere una concentrazione finale di un micromolare.
Lavare le cellule trasfettate una volta con PBS e aggiungere un mL per pozzo di una soluzione di substrato SNAP micromolare. Incubare le cellule per 20 minuti a 37 gradi in cinque per cento di CO2. Lavare le cellule tre volte con un mezzo libero dal rosso fenolo e aggiungere due ml per mezzo libero dal rosso fenolo.
Incubare le cellule per 30 minuti a 37 gradi centigradi in cinque per cento di CO2. Trasferire successivamente lo slittamento di copertura di tutti i campioni nella camera di imaging e lavare con il buffer di imaging a 500 microlitteri. Aggiungere il buffer di imaging a 500 microliti prima di passare alla configurazione FRED FCS.
La configurazione FRED FCS è dotata di un obiettivo ad acqua al microscopio confocale, due linee laser, un sistema di conteggio straniero singolo trapuntato nel tempo, due BMT ibridi e due azioni per la raccolta dei fotoni e il software di raccolta dati. È molto importante allineare la configurazione ogni volta prima della misurazione nelle cellule vive. Per regolare la messa a fuoco, il foro stenopeico e la posizione di colorazione, posizionare due soluzioni di calibrazione verde nanomolare su una slitta di copertura in vetro e accendere il laser a 485 nanometri e 560 nanometri azionato in pile, eccitazione interlacciata o modalità PI.
Concentrati sulla soluzione e regola la posizione dell'anello stenopeico e collare in modo tale da ottenere il più alto tasso di conteggio e il più piccolo volume confocale per ottenere la massima luminosità molecolare. Ripetere questo processo per i canali rossi con 10 nanomolari soluzione di calibrazione rossa e una miscela di entrambi. Posizionare 10 soluzione di DNA nanomolare sullo slittamento del coperchio di vetro e regolare la messa a fuoco del foro stenopeico e la posizione dell'anello del colletto in modo tale che i colori incrociati tra i canali di rilevamento verde e rosso siano più alti.
Questa è la fonte della più alta ampiezza. Per le misurazioni in cellule vive, trovare una cellula adatta limitando con la lampada di marcatura e osservando attraverso l'oculare. Accendi entrambi i laser in modalità PI e concentrati sulla membrana cercando il conteggio massimo al secondo.
Si prega di notare che potrebbe essere necessario ridurre la potenza del laser per i campioni di cellule. Preferibilmente meno di cinque microwatt all'obiettivo. Questo dipende molto dal floreale utilizzato e dalla configurazione.
Osserva le curve auto e cross coll dell'AR beta-2 legato alle sonde EGP e snap tag nell'anteprima online del software di raccolta dati e raccogli diverse misurazioni di ordinamento con un tempo di acquisizione compreso tra 60 e 180 secondi. Esporta il corso di correlazione e il contrasto da tutte le misurazioni. Si prega di fare attenzione qui a definire correttamente le finestre temporali di prompt e ritardo e utilizzare alcune opzioni di micro time getting nel software di correlazione dei dati.
In totale, sono necessarie tre diverse correlazioni. Correlazione automatica della finestra temporale del prompt del canale verde. Correlazione automatica dei canali rossi e della finestra temporale di ritardo.
E infine la correlazione incrociata del segnale del canale verde e della finestra temporale del prompt era il segnale del canale rosso nella finestra temporale del ritardo. Ecco le funzioni di correlazione automatica del FRED verde e rosso per le soluzioni e adattarle a un modello di diffusione 3 DT con un termine tripletto aggiuntivo necessario per calibrare la forma e la dimensione del volume di rilevamento confocale per i canali di colore a due usi, dove B è la linea di base della curva e il numero di molecole e messa a fuoco, TD il tempo di diffusione e S, lo zero su omega zero il fattore di forma dell'elemento volume confocale. La tripletta lampeggiante e la fisica fotografica sono descritte come ampiezza AR e tempo di rilassamento TR. Utilizzare il coefficiente di diffusione noto per i punti di calibrazione verde e rosso e ottenere fattori di forma per determinare le dimensioni e il volume dell'elemento di volume confocale infettivo.
Calcola lo spettro attraverso come IFR, il segnale fluorescente verde raccolto sui canali zero, e due nel canale di rilevamento giusto, canale uno e tre, come rapporto tra i segnali raccolti in background. Determinare l'aspettativa diretta del flusso di dati dell'accettore da parte delle lunghezze d'onda di eccitazione del donatore in base al rapporto tra il contrasto di fondo raccolto delle misurazioni di calibrazione rossa e l'eccitazione della finestra temporale rapida da parte del laser verde al conto corretto di sfondo proprio nell'eccitazione della finestra temporale di ritardo da parte del laser rosso. Calcola la luminosità molecolare di B sia la forza di flusso verde che rossa in base al contrasto raccolto sullo sfondo e per ottenere il numero di molecole e concentrati sull'adattamento di diffusione 3 DT.
Adatta sia le correlazioni ultra dal canale verde e rosso, sia attraverso la correlazione dal prompt verde e dal ritardo rosso del DNA a doppio livello al modello di diffusione 3 DT mantiene costanti i fattori di forma ottenuti per le funzioni di correlazione automatica. Il fattore di forma per le funzioni di correlazione incrociata è solitamente compreso tra questi due valori. Determinare l'ampiezza al tempo di correlazione zero in base ai valori del carattere del numero apparente di molecole e messa a fuoco.
Calcolare il rapporto di ampiezza per un campione era una co-diffusione al 100% della forza del pavimento verde e rosso. Adattare i campioni di cella a un modello appropriato. Il modo in cui viene mostrata la diffusione del recettore di membrana non curioso in modo bimodale è stato un tempo di diffusione breve, non lungo.
Inoltre, la fisica fotografica e il lampeggiamento della forza del pavimento devono essere considerati. Qui a TD1 e TD2, sono i due necessari ai tempi di diffusione. E uno è una frazione del primo tempo di diffusione In contrasto con la misurazione della calibrazione in cui i dadi liberi e la diffusione dei filamenti di DNA, tutte le direzioni, i recettori di membrana mostrano solo la diffusione 2D lungo le membrane cellulari calcolano la concentrazione di proteine con etichetta verde o rossa dal rispetto del numero di molecole e messa a fuoco.
E il volume dell'elemento volume confocale, usando la massa polare. Adatta le due correlazioni contralto del campione a doppia etichetta usando lo stesso modello del costrutto a livello singolo e della funzione di correlazione incrociata usando un modello di diffusione bimodale, Nota per una descrizione globale del sistema. Tutte e tre le colture devono essere adattate congiuntamente.
Il termine di diffusione è identico per tutte e tre le colture. E l'unica differenza è che il tempo di reputazione cade, la funzione di correlazione incrociata. Calcola la concentrazione di proteine del lavoro verdi o rosse dal rispettivo numero di molecole e focus e dal volume dell'elemento volume confocale.
Stimare la frazione o la concentrazione di proteine dell'etichetta verde e rossa interagenti dai campioni cellulari utilizzando i fattori di correzione ottenuti dai campioni di DNA, i rapporti di ampiezza del campione cellulare e le rispettive concentrazioni ottenute. Adattare le due correlazioni alter del campione FRED come un singolo campione etichettato e la correlazione incrociata anteriore a un modello di diffusione bimodale contenente un termine anti correlazione, in cui AF riflette l'ampiezza dell'anti correlazione totale e AR e TR la rispettiva ampiezza e tempo di rilassamento. In caso di cambiamenti di fluorescenza anti-correlati dovuti a FRED potrebbero essere necessari uno o più termini di correlazione anti, che hanno comportato un calo della funzione di correlazione incrociata di Fred in tempi di correlazione bassi in coincidenza con un aumento delle due funzioni di correlazione automatica.
Le misure di calibrazione delle soluzioni floreali verdi e rosse per i fattori di rasatura di 6,5 e i canali verdi e 6,8 nei canali rossi. Pertanto, il volume confocale ha le dimensioni di 1,4 e 1,9 femto più tardi in questo giorno di misurazione, la luminosità della molecola si trova a 12,5 kilohertz per molecola e 2,6 kilohertz per molecola. Abbiamo il 15% di diafonia dal floreale verde per nei canali rossi dopo l'eccitazione del donatore e il 38% di diretto tranne l'eccitazione della forma floreale rossa dal verde, dalla nostra misurazione del DNA, determiniamo i fattori di correzione per il volume di sovrapposizione confocale a 0,6 e 0,7 anche, le cellule trasfettate con costrutto a etichetta singola mostrano una diffusione bimodale bidimensionale sulla membrana cellulare dove circa la metà delle molecole si diffondono lentamente su la scala temporale da 50 a cento millisecondi e l'altra metà relativamente veloce intorno ai due millisecondi in entrambi i costrutti.
Inoltre, è presente la tripletta lampeggiante. Tuttavia, nel costrutto di snap di livello rosso viene acquisito un altro tempo di rilassamento a 180 microsecondi, che potrebbe derivare da Unbound snap straight. Dalla doppia etichetta stessa, transected con il costrutto anti snap in cui le due etichette su due lati diversi della membrana cellulare, sono state raccolte due misurazioni in meno del rumore e il mantello rosso sulla correlazione.
E la correlazione incrociata PI è piuttosto alta qui. Qui il 70% delle molecole, se si è lentamente sotto una scala temporale di cento millisecondi, e solo il 30% veloce intorno a un millisecondo, la frazione di molecole a doppia liberazione è bassa e si trova tra il 15 e il 25% I dati per lo snap CT sembrano migliori ed è meno rumoroso. Tuttavia, l'anti correlazione anteriore più profonda prevista non può essere vista ed è molto probabilmente la massa dall'elevata quantità di diafonia, l'eccitazione diretta e il battito triplicante di entrambe le forze floreali, e una volta che gli schemi di analisi dei dati che sfruttano l'intensità di fluorescenza raccolta DKS potrebbero aiutare a salvare questo come mostrato per il set di dati simulato.
Il vantaggio della tecnica Fred FCS è che insieme alla mobilità, possiamo studiare le dinamiche di conferenza dei GPCR. Tuttavia, eseguire FRED FAC nei laboratori è impegnativo e richiede buone celle trasfettate, un'etichettatura efficiente e una perfetta configurazione calibrata. Solo una coppia FRED pro force è anche molto cruciale.
Le fasi sperimentali critiche includono l'ottimizzazione dell'ottimizzazione della trasfezione, la minimizzazione dello sfondo e l'autofluorescenza. Inoltre e la pipeline di analisi degli atomi aiuterà a comprendere le varie dinamiche dei precettori nelle cellule vive. Speriamo che questo protocollo possa essere utile per eseguire l'approccio FRED FCS negli esperimenti sulle cellule vive.
