Questo protocollo descrive la sintesi di un sistema di nanoparticelle in grado di silenziare i geni in vivo fornendo siRNA ad alta efficienza. Semplicemente scambiando il peptide bersaglio e il carico utile di siRNA, le nanoparticelle fusogene possono essere utilizzate come potenziale formulazione terapeutica per malattie che richiedono modulazione genica in vivo. Abbiamo precedentemente pubblicato risultati utilizzando la nanopiastrina fusogena contro le infezioni batteriche gram-positive silenziando un gene che codifica per l'infiammazione nei macrofagi per porre fine all'infiammazione cronica.
Prima di eseguire questa procedura, assemblare una cella di incisione di Teflon contenente un wafer di silicio in una soluzione di acido fluoridrico da tre a uno. Eseguire una corrente alternata di una forma d'onda quadrata con una bassa densità di corrente di 50 milliampere per centimetro squadrato per 0,6 secondi e un'alta densità di corrente di 400 milliampere per centimetro al quadrato per 0,36 secondi ripetuti per 500 cicli. Una volta terminata l'incisione, rimuovere la cella dal circuito e risciacquare con cura la soluzione di acido fluoridrico utilizzando una siringa.
Quindi, sciacquare tre volte con l'etanolo. Per sollevare lo strato poroso dal wafer di silicio, riempire prima il pozzo della cella di incisione con 10 millilitri di una soluzione di acido fluoridrico uno-a-29. Quindi, eseguire una costante di 3,7 milliampere per centimetro squadrato per 250 secondi.
Una volta terminata l'incisione, rimuovere la cella dal circuito. Lo strato poroso di silicio può avere increspature visibili, indicando il distacco dal wafer di silicio cristallino. Lavare delicatamente la soluzione di acido fluoridrico e risciacquare tre volte ciascuna con etanolo e acqua.
Utilizzando una punta di pipetta, rompere saldamente la circonferenza dello strato di silicio poroso per un completo distacco. Usando l'etanolo, raccogliere i frammenti di silicio poroso, o chip, dalla cella di incisione teflon in una barca di pesatura. Quindi, trasferire i trucioli in una fiala di vetro per la conservazione.
Successivamente, sostituire l'etanolo nella fiala di vetro contenente i trucioli di silicio porosi con due millilitri di acqua priva di RNasi. Cappuccio saldamente e sigillare il flaconcino utilizzando Parafilm. Posizionare il flaconcino di vetro in un bagno sonicatore e sospeso in modo che il volume dei trucioli di silicio poroso sia completamente sommerso sotto la superficie del bagno d'acqua.
Per evitare una significativa perdita d'acqua durante la sonicazione, posizionare un pallone volumetrico riempito d'acqua, invertito in modo che l'apertura del pallone tocchi la superficie del bagno d'acqua. Quindi, sonicare i trucioli di silicio porosi per 12 ore a 35 kilohertz con una potenza RF di 48 watt. Dopo la sonicazione, posizionare il flaconcino di vetro su una superficie piana per un'ora per consentire alle particelle più grandi di depositarsi sul fondo.
Quindi, raccogliere il supernatante utilizzando una pipetta. In una fiala di vetro aggiungere 72,55 microlitri di soluzione DMPC, 15,16 microlitri di soluzione DSPE-PEG e 19,63 microlitri di soluzione DOTAP e mescolare mediante pipettazione. Posizionare il flaconcino in una cappa aspirante con un cappuccio sciolto per consentire al solvente di evaporare durante la notte.
Il film essiccato sarà una sostanza torbosa, dura e simile a un gel nella parte inferiore del flaconcino. Quindi, posizionare un tubo di microcentrifugo contenente 150 microlitri di nanoparticelle di silicio poroso in un bagno di sonicazione ghiacciato precedentemente preparato. Sotto un'ultrasonicazione di 15 minuti, pipettare delicatamente 150 microlitri di siRNA e 700 microlitri di cloruro di calcio bimolare nelle nanoparticelle di silicio poroso.
Rimuovere dal sonicatore il tubo contenente un millilitro di nanoparticelle di silicio poroso cariche di calcio cariche di siRNA. Riempire un ampio becher con acqua deionizzata. Immergere una membrana in policarbonato e quattro supporti filtranti galleggiandoli sulla superficie dell'acqua.
Quindi, assemblare un kit di estrusione liposoma seguendo le istruzioni del produttore. Successivamente, idratare il film lipidico essiccato nella fiala di vetro con un millilitro delle nanoparticelle di silicio poroso ricoperte di calcio cariche di siRNA. Pipetta fino a quando tutti i lipidi non si sono sollevati dal fondo della fiala e si osserva una soluzione torbosa e omogenea.
Aggiungere una barra di agitazione magnetica al flaconcino di vetro e posizionare il flaconcino su una piastra calda per riscaldare le particelle a 40 gradi Celsius mescolando magneticamente la soluzione per 20 minuti. In seguito, attaccare una siringa vuota su un lato dell'estrusore. Quindi, riempire un'altra siringa con un millilitro della soluzione di nanoparticella di silicio poroso rivestita di lipidi e attaccare la siringa all'altro lato dell'estrusore.
Iniziare l'estrusione spingendo lentamente il pistone per spingere le particelle da una siringa, attraverso la membrana in policarbonato e nell'altra siringa. Ripeti 20 volte. Quindi, raccogliere le particelle estruse in un tubo di microcentrifugo.
Preparare uno stock peptidico con una concentrazione di peptide di un milligrammo per millilitro in acqua priva di RNasi. Nel tubo di microcentrifugo contenente le nanoparticelle di silicio poroso rivestite di lipidi fusogene, aggiungere 100 microlitri del calcio peptidico e pipettare delicatamente. Mantenere il tubo statico a temperatura ambiente per 20 minuti.
Per rimuovere peptide o siRNA in eccesso e altri eccipienti, lavare in un filtro centrifugo da 30 kilodalton girando a 5.000 volte g a temperatura ambiente per un'ora. Centrifuga altre due volte con un millilitro di PBS sotto le stesse impostazioni. A seguito della centrifugazione, ha rimosoppo le nanoparticelle di silicio poroso fusogeno fusogeno coniugato peptide in PBS alla concentrazione desiderata.
Le particelle possono essere aliquote e conservate a meno 80 gradi Celsius per almeno 30 giorni. Una sintesi riuscita delle nanoparticelle di silicio poroso fusogeno dovrebbe produrre una soluzione omogenea, leggermente opaca, che può essere immagazzinata per 30 giorni e scongelata senza causare cambiamenti strutturali. La mancata ottimizzazione del rapporto e della concentrazione, così come i ripetuti cicli di congelamento-scongelamento possono portare all'aggregazione al caricamento.
Man mano che le particelle vengono estruse, il diametro idrodinamico medio delle nanoparticelle di silicio poroso fusogeno misurate dallo scattering dinamico della luce dovrebbe essere di circa 200 nanometri e il potenziale zeta medio approssimativamente positivo di sette millivolt. Dopo la modifica della superficie con peptidi mirati, il diametro complessivo dovrebbe essere inferiore a 230 nanometri e il potenziale zeta medio diminuisce a meno 3,4 millivolt. La fusione può essere confermata etichettando i lipidi fusogeni con il fluoroforo lipofilo DiI e osservando la localizzazione in vitro mediante microscopia confocale.
La fusione di successo si osserva quando i lipidi della nanoparticella di silicio poroso fusogeno trasferiscono il DiI alla membrana plasmatica e sono localizzati indipendentemente dai lisosomi. La fusione non riuscita mostrerà la localizzazione del DiI all'interno del citoplasma della cellula e la co-localizzazione con i lisosomi. Questo sistema di nanoparticelle fusogene viene ora utilizzato per applicazioni terapeutiche non solo nelle infezioni batteriche, ma anche nella terapia adiuvante contro il cancro e nell'immunoterapia del cancro.
Questo protocollo può essere ulteriormente ottimizzato per caricare più di siRNA. Il sistema di nanoparticelle fusogene ha mostrato un potenziale nel caricamento e nella fornitura di carichi utili anionici più grandi, come mRNA e complessi CRISPR/Cas9.
