Utilizzando questo sofisticato strumento non invasivo, possiamo monitorare in tempo reale la cinetica di crescita tumorale e la colonizzazione metastatica nei topi, che ha un grande potenziale nella terapia del cancro al seno e nella gestione della malattia. La combinazione di luciferasi e rilevamento della fluorescenza è una strategia utile per far progredire gli studi preclinici sulla progressione del cancro al seno e sulla gestione della malattia. Questo può essere applicato per studi di farmaci antitumorali.
Questo protocollo non è limitato al cancro al seno e potrebbe essere applicato ad altri carcinomi, come il polmone e il pancreas. Inizia coltivando le cellule MCF-7, MDA-MB-468 e MDA-MB-231 GFP e luciferasi-positive separatamente in una piastra da 16 centimetri all'80% di confluenza. Dopo aver raccolto le cellule per tripsinizzazione, seminare un numero crescente di cellule in ciascun pozzo in un piatto nero da 96 pozzetti.
Quindi, riempire tutti i pozzetti con 100 microlitri di DMEM e incubare per 16-24 ore in 37 gradi Celsius, incubatore a CO2 al 5%. Preparare la soluzione di luciferina in PBS a una concentrazione di 1,5 milligrammi per millilitro e conservare la soluzione a meno 20 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, lavare delicatamente le cellule con PBS prima di aggiungere 100 microlitri di soluzione di luciferina in ciascun pozzetto.
Attendere due minuti, quindi misurare l'attività della luciferasi in tutte le cellule del cancro al seno utilizzando la bioluminescenza. Prima di iniettare il mouse, trasferire cinque milioni di cellule MCF-7 e MDA-MB-468 in 200 microlitri di PBS e due milioni di cellule MDA-MB-231 GFP e luciferasi positive in 100 microlitri PBS. Preparare il topo anestetizzato per l'iniezione posizionando un cono sopra la testa in posizione supina.
Quindi, pulire l'area addominale del topo sopra la ghiandola mammaria con etanolo usando un batuffolo di cotone e sollevare la quarta ghiandola mammaria con una pinza prima di inserire un ago calibro 27 sotto il cuscinetto di grasso per iniettare lentamente 100 microlitri della sospensione cellulare preparata. Dopo l'iniezione, togliere il topo dal cappuccio e trasferirlo in una nuova gabbia sotto osservazione fino a quando non ritorna alla coscienza. Prima del rilevamento della bioluminescenza, trattenere il mouse cosciente tenendo il collo con la mano sinistra e inclinando la mano verso sinistra, con conseguente faccia del mouse verso l'alto con la parte inferiore del corpo in posizione supina.
Iniettare 100 microlitri di 30 milligrammi per millilitro luciferina per via intraperitoneale nel quadrante addominale inferiore sinistro del topo usando una siringa da un millilitro. Tenere il mouse per sette minuti senza anestesia, seguiti da tre minuti all'interno della camera di anestesia prima di misurare la cinetica del tumore. Mentre il mouse è in incubazione, aprire il software e inizializzare il sistema di imaging facendo clic sul pulsante Inizializza.
Mantenere la configurazione in esposizione automatica con il tempo di esposizione in auto a 60 secondi, il mezzo di binning a un'apertura di f / stop uno, il filtro di eccitazione bloccato e il filtro di emissione aperto. Al termine dell'inizializzazione, selezionare Imaging Wizard e Bioluminescence, quindi fare clic su Avanti, Apri filtro per selezionare il mouse nell'oggetto dell'immagine. Nella vista sul campo, selezionare lo stadio C a 10 centimetri e l'altezza del soggetto a 1,50 centimetri.
Quindi, fare clic su Image Setup Stage per C.Assicurarsi che il mouse sia posizionato sullo stage nella posizione supina corretta prima di chiudere la porta e fare clic sul pulsante Acquisisci. Attendi che un'immagine appaia sullo schermo. Ripetere la procedura per l'altro mouse.
Per rilevare le metastasi polmonari, coprire il forte segnale del tumore primario utilizzando una carta di cartone spessa ed esporre solo il lato ventrale dei polmoni verso la fotocamera. Acquisire l'immagine utilizzando gli stessi parametri descritti in precedenza. Le linee cellulari del cancro al seno sono state infettate da un vettore di lentivirus che esprime GFP fluorescente e soggetto a smistamento FAC.
Le cellule GFP-positive sono state ordinate due giorni dopo l'infezione, placcate e visualizzate al microscopio a fluorescenza. L'attività della luciferasi in vitro è stata confermata con un aumento dipendente dal numero cellulare dei livelli di attività della luciferasi. Inoltre, è stata trovata una correlazione lineare tra l'attività della luciferasi e il numero di cellule.
Dopo aver iniettato le linee cellulari del cancro al seno, i topi sono stati sottoposti a lettura di bioluminescenza ogni due settimane per determinare la cinetica di crescita del tumore. La cinetica di crescita tumorale era più veloce nelle linee cellulari MDA-MB-231 rispetto alle linee cellulari meno aggressive, MCF-7 e MDA-MB-468. L'attività di luminescenza è stata quantificata per tre linee cellulari.
Sei settimane dopo l'iniezione, i tumori raccolti sono stati trovati per mantenere l'espressione GFP. Inoltre, letture positive di bioluminescenza sono state ottenute dal polmone dell'intero topo in tempo reale. Il polmone è stato raccolto per verificare le colonie metastatiche positive e le colonie metastatiche sono state osservate per GFP e bioluminescenza.
È più importante fare attenzione durante l'esecuzione della procedura di iniezione. Un'iniezione impropria può portare a deviazione nel tasso di crescita del tumore o assenza di tumore. Possiamo esaminare le metastasi polmonari in vivo ed ex vivo rilevando l'espressione di GFP.
Inoltre, possiamo anche studiare l'istopatologia dei polmoni mediante colorazione basata sull'immunoistochimica. Questa tecnica può essere utile per esplorare le nuove domande, come l'effetto degli studi sull'efficacia dei farmaci.
