L'applicazione dell'ibridazione fluorescente in situ chiamata FISH alla stratificazione del rischio genetico nel mieloma multiplo è essenziale. La parte critica dei rapporti FISH non sono tutte le cellule nucleate, ma le plasmacellule clonali specificamente purificate o identificate mediante smistamento con perline magnetiche anti-CD138 o marcatura con immunoglobuline citoplasmatiche kappa o Lambda a catena leggera con test FISH chiamati cIg FISH. Interphase FISH dopo selezione delle plasmacellule o cIg FISH risulta essere significativo nella diagnosi di mieloma multiplo, a causa della percentuale relativamente più bassa di plasmacellule nel midollo osseo.
Tuttavia, questi metodi presentano alcune carenze, tra cui processi complessi, elevate richieste di campioni e alti costi sperimentali. Le plasmacellule possono essere rapidamente localizzate in uno striscio di midollo osseo. Sulla base di questo, utilizziamo lo striscio di midollo osseo FISH per il rilevamento di cellule di mieloma multiplo.
Questo studio è stato condotto secondo i principi della Dichiarazione di Helsinki e approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Zhongnan dell'Università di Wuhan. I campioni sono stati raccolti da un paziente con mieloma multiplo nel Dipartimento di Ematologia, Zhongnan Hospital dell'Università cinese di Wuhan. Posizionare il primo 0,2 millilitri di soluzione di midollo osseo su un vetrino monouso pulito, distribuire gli strisci di midollo osseo a spessore uniforme e code affilate rimuovendo rapidamente il midollo osseo, quindi asciugarlo naturalmente.
Coprire i film di midollo osseo con un millilitro di soluzione di Wright-Giemsa per circa 10 secondi a temperatura ambiente. Aggiungere un millilitro di tampone fosfato ai vetrini, è stata necessaria attenzione per evitare che la soluzione colorante si asciugasse o scorresse dai vetrini. Mescolare delicatamente la soluzione colorante e mantenerla per 15 minuti a temperatura ambiente.
Risciacquare i vetrini con acqua pulita e asciugarli all'aria a temperatura ambiente. Utilizzare la microscopia a luce diretta per rilevare le plasmacellule maligne, le plasmacellule devono essere ben disperse. Ora quello che vediamo sul campo sono le plasmacellule che sono abbastanza disperse.
Questa è una tipica plasmacellula nucleare Binuclear. Coprire l'area ibridata con soluzione fissativa per 10 minuti per scolorire e fissare le plasmacellule. Risciacquare il vetrino con acqua deionizzata e asciugarlo all'aria a temperatura ambiente.
Preriscaldare un barattolo contenente due volte il buffer SSC a 56 gradi Celsius a bagnomaria. Lavare lo striscio di midollo osseo preparato nel tampone SSC preriscaldato due volte per 10 minuti, seguito immergendolo in acqua deionizzata a temperatura ambiente. Disidratare lo striscio in un gradiente di etanolo 70%85% e 100% di etanolo ciascuno per un minuto.
Asciugare lo striscio all'aria per 10 minuti. Per prima cosa aggiungere TP53 sul centromero della miscela di sonda del cromosoma 17 all'area di ibridazione e coprirlo con una slitta di copertura premere delicatamente le pinzette a punta fine per rimuovere le bolle d'aria da sotto. Sigillare tutti i lati dello slittamento del coperchio con cemento di gomma per garantire una buona tenuta.
Dopo la solidificazione del cemento gommato, il vetrino è stato posizionato su una macchina automatica FISH la denaturazione è stata eseguita a 78 gradi Celsius per cinque minuti seguita dall'ibridazione a 37 gradi Celsius durante la notte. Prelevare lo scivolo dalla macchina FISH. Utilizzare una pinzetta a punta fine per rimuovere delicatamente il cemento di gomma.
Immergere la diapositiva in due volte SSC a temperatura ambiente per circa uno o due minuti per lavare via il coperchio. Lavare la diapositiva a 68 gradi Celsius tampone di preriscaldamento a bagnomaria per due minuti. Lavare le diapositive con due volte SSC in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per un minuto.
Impostare al buio per asciugare accuratamente per 10 minuti a 10 microlitri di DAPI nell'area ibridata, coprire con un coperchio. Visualizza vetrino ibridato utilizzando un filtro adatto impostato su un microscopio a fluorescenza, usa il filtro ottico monocromatico blu fluoroforo per osservare l'intensità di fluorescenza del nucleo cellulare. Acquisire immagini del nucleo cellulare in un set di filtri DAPI.
CEP17 è stato etichettato con fluorescenza verde. Utilizzare il filtro ottico a fluoroforo verde spettro per osservare la posizione di CEP17. Prendi l'immagine dei segnali CEP17 sotto il set di filtri verdi.
Il gene TP53 è stato etichettato con fluorescenza arancione. Usa il filtro ottico al fluoroforo arancione dello spettro per osservare TP53, prendi l'immagine dei segnali TP53 sotto il set, unisci queste tre immagini in un'interezza ed esamina le anomalie numeriche. In una normale cellula interfase si osservano due segnali arancioni e due verdi all'interno di un nucleo con fluorescenza blu che indicano una coppia di cromosomi normali 17.
I risultati hanno mostrato la morfologia e la genetica del midollo osseo in un paziente con mieloma multiplo. La figura A ha mostrato che il 15% delle plasmacellule in uno striscio di midollo osseo sono risultate avere più grandi e più scure e nucleari insieme a grandi quantità di citoplasma rispetto al normale. La figura B ha mostrato un'immagine in scala di grigi di rappresentante da una plasmacellula nucleata in uno striscio di midollo osseo.
La figura C ha mostrato quattro segnali arancioni e quattro verdi in un nucleo interfase di plasmacellula suggerendo che quattro copie del cromosoma 17 erano localizzate in un nucleo. La figura D ha mostrato che il cariogramma cromosomico anormale di questo paziente ha confermato due coppie di cromosomi 17 in un nucleo. Gli strisci di midollo osseo sono molto più facili da ottenere rispetto ai campioni di midollo osseo anticoagulante perché ottenere midollo osseo anticoagulato richiede procedure complesse per ottenere il nucleo.
Di conseguenza, abbiamo stabilito un metodo convincente per lo striscio di midollo osseo FISH per il rilevamento di cellule di mieloma multiplo.
