Siamo grati al dibattito, orientamento e sostegno da Drs. Michael Andreeff MD, PhD., E Jared Burks PhD. dal MD Anderson Citometria a flusso e Cellular Imaging Nucleo strumento. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dal National Cancer Institute (RC1-CA146381, CA-083639, R01NS06994, CA116199 e CA109451 per FCM. ELS è sostenuto anche dal Dipartimento dell&#39;Esercito di Difesa (BC083397).

Singenico Murino trapianto di midollo osseo (BMT), come approvato dai protocolli istituzionali IACUC (Nota: Il successo di questo protocollo richiede l&#39;utilizzo di qualsiasi tipo di cellula marcata (s) come destinazione per l&#39;analisi multispettrale, e per facilitare l&#39;analisi a valle, si può sfruttare qualsiasi genetica o etichettatura cellulare stabile. Suggeriamo che ogni cellula, tessuto o organo-a-essere può essere applicato a un modello di trapianto e che il trapianto può contenere molte popolazioni etichettati unici come la ricerca ritenga utile. Inoltre, multi-marcato sistemi cellulari , come quelli trovati in topi transgenici contenenti lignaggio più ristretta fluorescente popolazioni, possono essere progettati per eliminare le complicazioni del trapianto per lo studio di alcuni stati patologici. <ol><li> Mortalmente irradiare BMT topi riceventi con una singola dose di 9,5 Gy quattro ore prima di ricostituzione con l&#39;osso del donatore di midollo. (Destinatari BMT GFP dovrebbero essere 6-10 settimane di età). </li><li> Bagnare la pelliccia del mouse con il 70% di etanolo prima del clipping e peeling indietro per esporre gli arti posteriori con le forbici chirurgiche sterili. Rimuovere tutta la gamba compresa la cresta iliaca al sacroiliaca. Eliminare il piede tagliando appena sopra la caviglia e quindi rimuovere completamente tutto muscoli, legamenti e il tessuto in eccesso dal tessuto osseo. Osseo filo dalla tibia, fibia e cresta iliaca con un ago 23 G utilizzando 2% FBS in PBS sterile (PBS-2). (Donatori RFP BMT dovrebbero essere sacrificati in base alle norme istituzionali.) </li><li> Fetta e delicatamente schiacciare l&#39;osso residuo in frammenti utilizzando un bisturi e pinza e poi posto in tubo da 50 ml con 3 mg / ml di collagenasi I per 1 ora a 37 ° C a 300 rpm. </li><li> Top fuori il tubo con PBS-2 e raccogliere il surnatante in una nuova provetta e si combinano con le cellule arrossate. Spin down a 250rpm per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Risospendere le cellule in PBS-2 e filtrare attraverso filtro a 40 nm cellulare. A questo punto, le cellule possono essere etichettati per fluorescenT attivate cella (FACS) se si vuole manipolare popolazioni specifiche per il BMT. </li><li> Risospendere 2 x 10 6 cellule per 100 microlitri di PBS, per topo. Utilizzare 29 G ago per iniettare sistemica in irradiati topi riceventi GFP da coda o retro-orbitale vena-conica-side-up. Iniettare un mouse con 100 microlitri di PBS solo come controllo di attecchimento. Usare una lampada di calore per dilatare i vasi prima dell&#39;iniezione e utilizzare un sistema di ritenuta iniezione coda vena dopo l&#39;iniezione. Avere garza sterile a disposizione per applicare una leggera pressione per l&#39;iniezione palo coda. </li><li> Tre settimane dopo BMT, raccolgono retro-orbitale sangue e analizzare mediante citometria a flusso per confermare la presenza di cellule circolanti GFP e l&#39;assenza di cellule circolanti RFP. Il mouse di controllo sarà morto, a questo punto. </li></ol> 2. Tumore Engraftment Secondo Istituzionali Linee guida IACUC <ol><li> Crescere ID8 ovariche cellule tumorali murine in vitro prima in vivo di iniezione (1 x 10 6 cells per mouse). Giorno dell&#39;iniezione, Trypsinize cellule, lavare con PBS e risospendere in PBS a 1 x 10 6 cellule per 100 microlitri. </li><li> Iniettare cellule tumorali nella cavità intaperitoneal del mouse, ago deve essere smussatura-side-up. Sterilizzare vista l&#39;iniezione con il 70% di etanolo. Iniettare in basso a sinistra o quadrante inferiore destro dell&#39;addome (craniale e mediale leggermente al set inferiore di capezzoli addominali di topo femmina), evitare di colpire gli organi. Trattenere il mouse afferrando per la collottola e tenendo la coda con il mignolo o l&#39;anello dito. I topi possono essere anestetizzati con isoflurano per questa procedura. </li><li> Sacrifica i topi quando i segni di tumore attecchimento, come il leggero gonfiore addominale, sono evidenti. Questo si verificherà oltre 4-12 settimane. </li><li> I tumori Accise dalla cavità IP. Tumori all&#39;interno della cavità sarà simile a noduli bianchi su e intorno alla superficie degli organi. Con un bisturi, rimuovere tumori e porre in un tubo / barattolo di formalina al 10% per 24 ore fissaggio. Istologica pil risarcimento può essere demandate a nucleo patologia / istologia se i reagenti e materiali non sono prontamente disponibili per paraffina e preparazione del vetrino. Tessuto sezione in 5-8 micron fette su vetrini per le successive procedure di colorazione. </li></ol> 3. Multi-parametro immunofluorescenza <ol><li> Preparare vetrini di controllo unico colore per ogni sonda fluorescente utilizzato nell&#39;esperimento. In questo scenario, vengono utilizzati quattro colori. Pertanto, quattro slitte per ogni singolo colore e anche uno scivolo per il controllo del rumore di fondo e infine uno scivolo per la colorazione completa combinazione. (Totale vetrini = 6) Tutti i vetrini saranno trattati fianco a fianco in modo identico per minimizzare variazione sperimentale. </li><li> Cuocere sezioni di paraffina a 56 ° C per 1 ora. </li><li> Lavare i vetrini 3x 10 min in xilene. </li><li> Lavare 2x 5 min al 100% di etanolo. </li><li> Lavare 1x 3 min 95% di etanolo </li><li> Lavare 1x 2 min90% di etanolo. </li><li> Lavare 1x 2 min70% di etanolo. </li><li&gt; Wash 1x 2 min in acqua. Lentamente immergere il rack per colorazione in e fuori 10x acqua. </li><li> Durante l&#39;ultima serie di lavaggio, pre-bollire tampone di citrato di sodio per 2 minuti (forno a microonde in alto). (Può sostituire con tampone tris-EDTA seconda delle condizioni anticorpi in uso) </li><li> Lessare i vetrini per 20 min in tampone sodio citrato (microonde a potenza 10% o in pentola a pressione). Se il buffer di bolle, spegnete forno a microonde e lasciate riposare. </li><li> Rimuovere dalla fonte di calore e lasciare le diapositive riposare per 30 min in tampone citrato di sodio raffreddare. </li><li> Sciacquare i vetrini in acqua per 5 minuti. </li><li> Mark intorno sezioni tumorali con Pap Pen e mettere 2% BSA / 1% FBS acido maleico tampone bloccante per 1 ora. Preparare i vetrini singolarmente per non farli asciugare durante questa fase. </li><li> Preparare gli anticorpi primari diluizione ottimale in tampone di bloccaggio. (Se gli anticorpi in uso sono tutti di specie differenti (o IgG catena variazione-ex: IgG1 vs IgG2a della stessa specie) possono essere usati in combinazione come duranteingle periodo di incubazione. Se le specie anticorpali sovrappongono, poi incubazioni devono essere eseguite sequenzialmente per minimizzare anticorpi cross-reazione.) </li><li> A questo punto, lasciare due diapositive con bloccaggio solo buffer. Questi due scivoli serviranno come controllo senza macchia e controllo macchia nucleare. Gli altri controlli singoli colori verranno incubate con anticorpi primari individuali. Solo la diapositiva analisi avrà una combinazione di anticorpi primari. </li><li> Incubare con anticorpo primario in una scatola della camera umidità sulla lenta rotazione shaker overnight a 4 ° (~ 16-20 hr) (Nota: quando si lavora con 4 + fluorofori, colorazione sequenziale o coniugazione diretta può essere necessario minimizzare anticorpi cross-reazione . In queste circostanze, ripetere i passaggi 1,16-1,21 finché tutti gli anticorpi vengono applicati ai vetrini.) </li><li> Lavare i vetrini per 10 min in PBST (2x) delicatamente shaker </li><li> Mentre lavaggio sta andando, preparare AlexaFluor 488, 594 e 647 anticorpi secondari per una diluizione finaledi 1:1000 in tampone di bloccaggio. (Assicurarsi che questi anticorpi e diluizioni sono conservati a 4 ° C e al buio in ogni momento a preservare fluorescenza tra i lotti e nel tempo.) </li><li> Sui vetrini singoli controllo del colore, posizionare singoli diluizioni AlexaFluor corrispondenti alle specie di anticorpo primario utilizzato. Tutti gli anticorpi secondari saranno collocati sul vetrino analisi. I vetrini di controllo non colorati e il nucleare macchiati rimarranno con tampone di arresto nel corso di questo passo. </li><li> Incubare in una scatola della camera di umidità (coperto con un foglio di alluminio per evitare l&#39;esposizione alla luce) sulla lenta agitatore rotante a temperatura ambiente per 2 ore. </li><li> Lavare i vetrini per 5 min in PBST (2x) delicatamente shaker. Coprire con un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce. </li><li> Aggiungi DAPI (1:10.000) per 1 min alla diapositiva solo DAPI e la diapositiva di analisi. Coprire con un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce. Gli altri vetrini possono essere lasciati coperto in contenitori di lavaggio. </li><li> Lavare le due DAPI incubatevetrini in un contenitore separato per i primi 5 minuti di lavaggio, per non contaminare le altre diapositive con macchia DAPI. Per il secondo 5 min di lavaggio, le diapositive possono essere combinati in PBST (tutti i lavaggi dovrebbero essere condotti su un agitatore). Coprire con un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce. </li><li> Diapositive breve tuffo in acqua prima copertura di scivolare (1,5 di spessore con mezzo di montaggio acquoso di preservare fluorescenza) </li><li> Lasciate asciugare 3 ore al buio a temperatura ambiente. </li><li> Sigillare i bordi del vetrino con unghie indurente. (Non usare lo smalto come acetone può placare il segnale fluorescente). </li><li> Analizzare i vetrini immediatamente o conservare a 4 ° C per le analisi future. </li></ol> 4. Imaging multispettrale <ol><li> Raccogliere immagini multispettrali, utilizzando una macchina fotografica Nuance EX (contenente un filtro accordabile a cristalli liquidi) su una Olympus X-63 microscopio verticale con il software di Nuance per la raccolta dati. </li><li> Raccogliere le immagini utilizzando un obiettivo olio per aumentare la risoluzione. </li><li> Initial impianto include fissare la gamma spettrale per ciascun fluoroforo in uso. <ol class="lalpha"><li> Per 4 colori: <ol class="lroman"><li> DAPI: 420-480nm </li><li> AF488: 490-580nm </li><li> AF594: 590-640nm </li><li> AF647: 650-720nm </li></ol></li></ol></li><li> Prendere una immagine iniziale della diapositiva analisi per ottenere i tempi di esposizione adeguati per ciascuno degli intervalli spettrali. </li><li> Creare &quot;libreria spettrale&quot; che il software utilizzerà per identificare e separare il rapporto segnale-rumore dei fluorofori uno dall&#39;altro e segnale di fondo. (Nota: Ogni fluorocromo deve avere la propria singola diapositiva controllo del colore per assemblare una libreria spettrale con relative curve di lunghezza d&#39;onda per assicurare la corretta analisi dei set di dati Esempio: 3 fluorofori = 4 vetrini di controllo; 5 fluorofori = 6 vetrini di controllo.). <ol><li> Immagine diapositiva senza macchia prima. Questa diapositiva sarà designato all&#39;interno del coll spettraley come sfondo.&gt; </li><li> Immagine del DAPI solo far scorrere secondo. Questa diapositiva verrà utilizzato per designare i nuclei DAPI-macchiate con il tool &quot;disegnare&quot; e sarà salvato all&#39;interno della libreria spettrale come DAPI.&gt; </li><li> Immagine La diapositiva terzo AF488-only. Questa diapositiva verrà utilizzato per designare le regioni AF488-colorati con lo strumento &quot;disegnare&quot; e sarà salvato all&#39;interno della libreria spettrale come AF488.&gt; </li><li> Immagine l&#39;AF594 solo scivolare al quarto posto. Questa diapositiva verrà utilizzato per designare le regioni AF594-colorati con lo strumento &quot;disegnare&quot; e sarà salvato all&#39;interno della libreria spettrale come AF594.&gt; </li><li> Immagine l&#39;AF647 solo far scorrere quinto. Questa diapositiva verrà utilizzato per designare le regioni AF647-colorati con lo strumento &quot;disegnare&quot; e sarà salvato all&#39;interno della libreria spettrale come AF647.&gt; </li><li> A seguito della raccolta di ciascun componente spettrale individuo,salvare la libreria spettrale e il protocollo.&gt; </li></ol></li><li> Una volta che la libreria spettrale è completa, trovare regioni di interesse sul vetrino sul microscopio analisi e raccogliere / salvare le immagini.&gt; </li></ol> 5. Analisi quantitativa di immagini multispettrali <ol><li> Importare un assortimento rappresentativo di immagini acquisite utilizzando Nuance InForm Software. </li><li> Aprire la libreria spettrale salvato come indicato dal programma </li><li> Identificare le regioni di tessuto di interesse da analizzare. (Ad esempio tessuto tumorale rispetto tessuto adiposo). </li><li> Identificare le cellule individuali basate su DAPI-macchia. Citoplasma sarà definito automaticamente in base alla forma del nucleo. </li><li> Scegli il fluorescente di intensità read-out di scelta per ciascun parametro fluorescente (ad esempio media, deviazione standard) </li><li> Batch il acquisito le immagini e lasciare che il processo software utilizzando l&#39;algoritmo proposto. </li><li> Quando l&#39;elaborazione delle immagini è terminata, unirei file dei risultati. </li><li> Aprire i risultati in Excel (o qualsiasi altro pacchetto software di analisi) e tracciare due intensità di fluorescenza contro l&#39;altro sull&#39;asse XY. Ogni intensità fluorescente è dato per cella. Le cellule doppio positive appariranno nel quadrante in alto a destra. L&#39;utente deve definire le intensità di fluorescenza di base. </li></ol>

<ol>
	<li>Kidd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+the+tumor+microenvironment:+quantitative+assessment+of+adipose-derived+and+bone+marrow-derived+stroma.">Origins of the tumor microenvironment: quantitative assessment of adipose-derived and bone marrow-derived stroma.</a> PLoS ONE. 7, e30563 (2012).</li><li>Quintavalla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+labeled+mesenchymal+stem+cells+(MSCs)+maintain+multilineage+potential+and+can+be+detected+following+implantation+into+articular+cartilage+defects.">Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects.</a> Biomaterials. 23, 109-119 (2002).</li><li>Sasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+are+recruited+into+wounded+skin+and+contribute+to+wound+repair+by+transdifferentiation+into+multiple+skin+cell+type.">Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type.</a> Journal of immunology. 180, 2581-2587 (2008).</li><li>Spaeth, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+transition+to+tumor-associated+fibroblasts+contributes+to+fibrovascular+network+expansion+and+tumor+progression.">Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression.</a> PLoS ONE. 4, e4992 (2009).</li><li>Wels, J., Kaplan, R. N., Rafii, S., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+neighbors+and+distant+invaders:+Tumor-associated+niche+cells.">Migratory neighbors and distant invaders: Tumor-associated niche cells.</a> Genes and Development. 22, 559-574 (2008).</li><li>Weis, S. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+molecular+pathways+and+therapeutic+targets.">Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets.</a> Nat. Med. 17, 1359-1370 (2011).</li><li>Bataille, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+immunofluorescence+on+paraffin-embedded+tissue+sections.">Multiparameter immunofluorescence on paraffin-embedded tissue sections.</a> Applied immunohistochemistry &amp; molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 14, 225-228 (1097).</li><li>van Vlierberghe, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-color+staining+combining+fluorescence+and+brightfield+microscopy+for+simultaneous+immune+cell+phenotyping+and+localization+in+tumor+tissue+sections.">Four-color staining combining fluorescence and brightfield microscopy for simultaneous immune cell phenotyping and localization in tumor tissue sections.</a> Microscopy research and technique. 67, 15-21 (2005).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC cell biology. 9, 13 (2008).</li><li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li><li>Belizario, J. E., Akamini, P., Wolf, P., Strauss, B., Xavier-Neto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+routes+for+transgenesis+of+the+mouse.">New routes for transgenesis of the mouse.</a> Journal of applied. 53, 295-315 (2012).</li></ol>

FCM, CMB, e ELS non hanno conflitti e niente da dichiarare.

Qui si descrive l&#39;applicazione dell&#39;imaging multispettrale descriviamo come interrogazione MIMicc-multispettrale di composizioni cellulari multiplexati, per analizzare le componenti stromali del midollo osseo derivate del microambiente tumorale, tuttavia questa metodologia e concetto può essere applicato per decifrare altri elementi cellulari che compongono un complesso tessuti come quelli osservati durante le reazioni di cicatrizzazione o durante un tessuto rigenerativo. In questi esperimenti utilizziamo topi ...

Comprendere lo sviluppo dei tessuti e la riparazione è significativo per chiarire che partecipano componenti cellulari nella guarigione delle ferite, 2,3 medicina rigenerativa, biologia dello sviluppo e biologia del tumore. In circostanze di riparazione, numerosi tipi di cellule infiltrano il microambiente circostante per aiutare nella vascolarizzazione, ECM deposizione, la proliferazione e la ristrutturazione dei tessuti. Fattori cellulari e fenotipi possono essere identificati sulla base di multiparametrico, marcatori multiplex che possono identificare la localizzazione, stato di differenziazione e l&#39;interazione tra componenti cellulari all&#39;interno del microambiente indagato. Qui, descriviamo lo sviluppo del tumore come un esempio tipico di questo modello di trapianto multicolor-multicellulare seguita da immagini multispettrali e la metodologia unmixing spettrale. Progressione tumorale è un processo a più fasi che è segnata da diverse funzionalità acquisite che includono una maggiore proliferazione, unproprietà ntiapoptotic, invasive e angiogenici. 4, dello sviluppo tumorale è facilitata da cellule non neoplastiche che vengono reclutate nell&#39;ambiente circostante per fornire fattori di crescita, matrici strutturali, reti vascolari e modulazione immunitaria. 1,5,6 Questo microhabitat consiste di cellule derivate da , i tessuti locali vicini come adiposo e vasi sanguigni e fonti lontane come il midollo osseo cellule derivate 1. Il grado di incorporazione di cellule non neoplastiche dipende dalla richiesta dal tumore, che spesso corrisponde con la fase / grado del tumore. Per comprendere il ruolo del microambiente tumorale solidale, si deve capire l&#39;origine e il potenziale di differenziazione delle popolazioni di cellule non neoplastiche. Questo protocollo è stato progettato per favorire l&#39;interpretazione della progressione tumorale attraverso la visualizzazione sia dei componenti cellulari derivate midollo osseo, e la deriv tessuto localecellule ed. Utilizzando fluorescenti giornalista-gene che esprime topi transgenici, abbiamo trapiantato GFP (proteina verde fluorescente) del midollo osseo in una RFP letale irradiato (proteina rosso fluorescente) del mouse. Dopo il successo attecchimento del midollo osseo, una linea di cellule tumorali singenico viene iniettato ortotopicamente e ha permesso di attecchire per 4-8 settimane. Il tumore risultante viene asportato dal mouse e trattati per immunofluorescenza (IF) colorazione di visualizzare i componenti stromali. Multiplexing IF marcatori è una tecnica comunemente usata che prevede una significativa ottimizzazione 7-9, ma utilizzando una piattaforma di imaging / unmixing multispettrale migliora il potenziale di combinazioni di marcatori fluorescenti che possiedono sovrapposizione spettrale. Qui vi presentiamo una tecnica che chiamiamo interrogatorio MIMicc-multispettrale di composizioni cellulari multiplexati a macchiare e analizzare fino a otto marcatori all&#39;interno di una sezione di tumore su una singola diapositiva, al fine di analizzare le origini cellulare, differenziamento cellulare strecchi e le interazioni cellula-cellula delle parti entro il microambiente tumorale. Questo esempio semplificato ha il potenziale per essere ampliato su per analizzare cinque, sei o più marker utilizzando anticorpi o di espressione fluorescente intracellulare promotore-driven. Tabella 1 elenca i potenziali combinazioni di anticorpi fluorescenti colorazione con specie adatte presi in considerazione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>.2 &mu;m filter</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>09-740-35A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>10 ml lure lock </td>
			<td >BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td >Cardinal</td>
			<td>BF305122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>40nm filter</td>
			<td >BD</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 ml conical tube</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 488-ms1</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 594-Rb</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 647-ch</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>A21449</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSA</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td >Corning</td>
			<td>2940-243</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CRI-Nuance</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dapi</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td >CellGro</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td >Dharmacon</td>
			<td>4004-DV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFP-ms1</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>ab38689</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insulin needle</td>
			<td >BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td >Acros</td>
			<td>100-16-7</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Moisture chamber box</td>
			<td >Evergreen</td>
			<td>240-9020-Z10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td >dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nail hardener</td>
			<td >Sally Hansen</td>
			<td>2103</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>Ab2601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen/Strep L Glut</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Steril PBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>14040-182</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>252000-56</td>
			<td> </td>
		 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 Blocking Buffer	
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>maleic acid</td>
 <td>14.51 g </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>10.95 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaOH pellets (to 7.5pH)</td>
 <td>9+g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>250 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. 
	Antigen retrieval buffers:
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>1.21 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>0.37 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*Store at RT for 3 months or at 4 &deg; C for longer
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tri-sodium citrate (dihydrate)</td>
 <td>2.94 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCl (adjust pH to 6.0)</td>
 <td>1N</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
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 </table>

quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions

Con il desiderio di comprendere contributi di molteplici elementi cellulari allo sviluppo di un tessuto complesso, come i numerosi tipi di cellule che partecipano rigenerazione tissutale, formazione di tumori, o vasculogenesi, abbiamo ideato un multicolore modello trapianto cellulare di sviluppo del tumore in che le popolazioni di cellule provengono da diversi colori giornalista topi del gene modo fluorescente e vengono trapiantate, innestate o iniettati dentro e intorno un tumore in via di sviluppo. Queste cellule colorate vengono poi reclutati e inseriti nel stroma tumorale. Al fine di valutare quantitativamente midollo osseo derivate cellule stromali del tumore, abbiamo trapiantato GFP che esprimono tutta transgenica midollo osseo in RFP letale irraggiato esprimere topi come approvato dalla IACUC. 0ovarian tumori che sono stati ortotopicamente iniettato nei topi trapiantati sono stati asportati 6-8 settimane dopo l&#39;attecchimento e analizzati per marcatore midollo osseo di origine (GFP) e marcatori anticorpali per rilevare tumore associatostroma utilizzando tecniche di imaging multispettrale. Abbiamo poi adattato una metodologia che chiamiamo MIMicc-multispettrale Interrogatorio di composizioni cellulari multiplex, utilizzando unmixing multispettrale di fluoroprobes per valutare quantitativamente cui etichettato cellule venuto da cui le popolazioni a partire (in base giornalista originali etichette geni), e la nostra capacità di unmix 4, 5 , 6 o più spettri per aumenti di diapositive, abbiamo aggiunto immunoistochimica aggiuntivi associati a linee cellulari o differenziazione per aumentare la precisione. Utilizzando il software di rilevare i segnali multiplex fluorescente co-localizzate, le popolazioni stromali tumorali possono essere rintracciati, annotate e caratterizzate sulla base di marcatore colorazione. 1

Usando una tecnica di imaging multispettrale per analizzare i tumori innestati nel nostro modello di topo transgenico BMT, siamo in grado di discernere i componenti tumori stromali che sono di origine midollare. Il primo BMT è stata confermata tre settimane post-trapianto mediante citometria di flusso (Figura 1). Ortotopicamente iniettato tumori ovarici senza etichetta seguente BMT conferme attecchimento sono stati asportati e fissati in formalina 6 settimane dopo l&#39;iniezione iniziale del tumore. P...

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Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

Masse di tessuto complesse, da organi di tumori, sono composti da vari elementi cellulari. Abbiamo chiarito il contributo di fenotipi cellulari all&#39;interno di un tessuto utilizzando multi-etichettati topi transgenici fluorescenti in combinazione con multiparametrica immunofluorescenza seguita da unmixing spettrale di decifrare origine cellulare e caratteristiche cellulari basati su espressione della proteina.

Quantitative Analysis multispettrali Dopo tessuto fluorescente Trapianto per la visualizzazione delle origini cellulari, tipi e interazioni

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

quantitative-multispectral-analysis-following-fluorescent-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

9.3K Views.  MD Anderson Cancer Center.  Masse di tessuto complesse, da organi di tumori, sono composti da vari elementi cellulari. Abbiamo chiarito il contributo di fenotipi cellulari all'interno di un tessuto utilizzando multi-etichettati topi transgenici fluorescenti in combinazione con multiparametrica immunofluorescenza seguita da unmixing spettrale di decifrare origine cellulare e caratteristiche cellulari basati su espressione della proteina. 

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Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment for melanoma remains surgical excision, therefore, the key to extended survival is early detection 2,3. Considering the large numbers of patients diagnosed every year and the limitations in accessing specialized care quickly, the development of objective in vivo diagnostic instruments to aid the diagnosis is essential. New techniques to detect skin cancer, especially non-invasive diagnostic tools, are being explored in numerous laboratories. Along with the surgical methods, techniques such as digital photography, dermoscopy, multispectral imaging systems (MelaFind), laser-based systems (confocal scanning laser microscopy, laser doppler perfusion imaging, optical coherence tomography), ultrasound, magnetic resonance imaging, are being tested. Each technique offers unique advantages and disadvantages, many of which pose a compromise between effectiveness and accuracy versus ease of use and cost considerations. Details about these techniques and comparisons are available in the literature 4.
Infrared (IR) imaging was shown to be a useful method to diagnose the signs of certain diseases by measuring the local skin temperature. There is a large body of evidence showing that disease or deviation from normal functioning are accompanied by changes of the temperature of the body, which again affect the temperature of the skin 5,6. Accurate data about the temperature of the human body and skin can provide a wealth of information on the processes responsible for heat generation and thermoregulation, in particular the deviation from normal conditions, often caused by disease. However, IR imaging has not been widely recognized in medicine due to the premature use of the technology 7,8 several decades ago, when temperature measurement accuracy and the spatial resolution were inadequate and sophisticated image processing tools were unavailable. This situation changed dramatically in the late 1990s-2000s. Advances in IR instrumentation, implementation of digital image processing algorithms and dynamic IR imaging, which enables scientists to analyze not only the spatial, but also the temporal thermal behavior of the skin 9, allowed breakthroughs in the field.
In our research, we explore the feasibility of IR imaging, combined with theoretical and experimental studies, as a cost effective, non-invasive, in vivo optical measurement technique for tumor detection, with emphasis on the screening and early detection of melanoma 10-13. In this study, we show data obtained in a patient study in which patients that possess a pigmented lesion with a clinical indication for biopsy are selected for imaging. We compared the difference in thermal responses between healthy and malignant tissue and compared our data with biopsy results. We concluded that the increased metabolic activity of the melanoma lesion can be detected by dynamic infrared imaging.

We demonstrated that malignant pigmented lesions with increased metabolic activity generate quantifiable amounts of heat and the measurement of the transient thermal response of the skin to a cooling excitation allows quantitative identification of melanoma and other skin cancers (vs. non-proliferative nevi) at an early stage of the disease.

Visualizzazione quantitativa e diagnosi del tumore della pelle utilizzando Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

Ricerca

Medicina

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

Una migliore visualizzazione delle metastasi polmonari a risoluzione singola cella in Mouse di combinata<em&gt; In-situ</emPerfusione&gt; del tessuto polmonare e X-Gal colorazione del<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged cellule tumorali

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

Isolamento dei Nuclei Cardiomyocyte dal post-mortem del tessuto

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

Analisi quantitativa di proteomi cromatina nella malattia

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become proficient in and utilize this technique, it is now widely used by many laboratories around the world. A significant refinement to the original technique was developed and reported in 2001 by Niimi. Described here are the techniques that have evolved over more than a decade in the hands of three surgeons (Plenter, Grazia, Pietra) in our center. These techniques are now being passed on to a younger generation of surgeons and researchers.
Based largely on the Niimi experience, the procedures used have evolved in the fine details - details which we will endeavor to relate here in such a way that others may be able to use this very useful model. Like Niimi, we have found that a video aid to learning is a priceless resource for the beginner.

The manuscript describes the steps required to perform the heterotopic heart transplant in the mouse.

Murini eterotopica cuore Tecnica Trapianto

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which disrupt normal brain function. Despite treatment with currently available antiepileptic drugs targeting neuronal functions, one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant. In this condition, surgical resection of the brain area generating seizures remains the only alternative treatment. Studying human epileptic tissues has contributed to understand new epileptogenic mechanisms during the last 10 years. Indeed, these tissues generate spontaneous interictal epileptic discharges as well as pharmacologically-induced ictal events which can be recorded with classical electrophysiology techniques. Remarkably, multi-electrode arrays (MEAs), which are microfabricated devices embedding an array of spatially arranged microelectrodes, provide the unique opportunity to simultaneously stimulate and record field potentials, as well as action potentials of multiple neurons from different areas of the tissue. Thus MEAs recordings offer an excellent approach to study the spatio-temporal patterns of spontaneous interictal and evoked seizure-like events and the mechanisms underlying seizure onset and propagation. Here we describe how to prepare human cortical slices from surgically resected tissue and to record with MEAs interictal and ictal-like events ex vivo.

We here describe how to perform multi-electrode array recordings of human epileptic cortical tissue. Epileptic tissue resection, slice preparation and multi-electrode array recordings of interictal and ictal events are demonstrated in detail.

Multi-elettrodi array registrazioni di umano Epileptic postoperatoria corticale del tessuto

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Murine Kidney Transplant Technique

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become proficient in and utilize this technique, it is now widely used by many laboratories around the world. A significant refinement to the original technique using the donor aorta to form the arterial anastomosis instead of the renal artery was developed and reported in 1993 by Kalina and Mottram 2 with a further advancement coming from the same laboratory in 1999 3. While one can become proficient in this model, a search of the literature reveals that many labs still experience a high proportion of graft loss due to arterial thrombosis. We describe here a technique that was devised in our laboratory that vastly reduces the arterial thrombus reported by others 4,5. This is achieved by forming a heel-and-toe cuff of the donor infra-renal aorta that facilitates a larger anastomosis and straighter blood flow into the kidney.

The goal of this manuscript is to describe the steps required to perform a kidney transplant in a mouse, paying particular attention to the details of the arterial anastomosis.

Rene Murine Tecnica trapianto

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

Vena interposizione Modello: un modello adatto per studiare Bypass Graft pervietà

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

Visualizzazione quantitativa di leucociti infiltrati in un modello di murina della miocardite fulminante mediante microscopia a foglio chiaro

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine balloon denudation model, which is comparable with established vessel injury models in large animals. The aorta denudation model with balloon catheters mimics the clinical setting and leads to comparable pathobiological and physiological changes. Briefly, after performing a horizontal incision in the aorta abdominalis, a balloon catheter will be inserted into the vessel, inflated, and introduced retrogradely. Inflation of the balloon will lead to intima injury and overdistension of the vessel. After removing the catheter, the aortic incision will be closed with single stiches. The model shown in this article is reproducible, easy to perform, and can be established quickly and reliably. It is especially suitable for evaluating expensive experimental therapeutic agents, which can be applied in an economical fashion. By using different knockout-mouse strains, the impact of different genes on MH development can be assessed.

This article demonstrates a murine model to study the development of myointimal hyperplasia (MH) after aortic balloon injury.

Basato su palloncino ferita per indurre iperplasia Myointimal nell'Aorta addominale di Mouse

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine ...