Ringraziamo il Flow Cytometry Core di URMC. Questo lavoro è stato sostenuto dall'American Society of Hematology Scholar Award, dal premio della Leukemia Research Foundation e dalle sovvenzioni NIH R01DK133131 e R01CA266617 assegnato a J.B.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con i protocolli approvati dal Comitato per le risorse animali dell'Università di Rochester. I topi sono stati allevati e mantenuti nelle strutture per la cura degli animali dell'Università di Rochester. Per modellare le MDS ad alto rischio, viene utilizzato il modello murino NHD1319 disponibile in commercio. In questo modello, le cellule stromali del midollo osseo vengono analizzate in topi femmina NHD13 a 8 settimane di età, prima dell'insorgenza della malattia. De novo L'AML viene generato come descritto in precedenza 6,11,20. Gli oncogeni utilizzati per indurre la LMA, come MLL-AF9 e NRas, sono marcati con GFP o YFP, consentendo l'analisi delle popolazioni di midollo osseo GFP non leucemiche utilizzando la citometria a flusso. In breve, topi femmina C57BL/6J di 10 settimane vengono trapiantati con cellule AML murine GFP/YFP+ e il midollo osseo viene raccolto 2 settimane dopo il trapianto. Mentre i topi femmina sono utilizzati in questo studio a scopo dimostrativo, questo protocollo può essere condotto con topi maschi o femmine. Può anche essere eseguita utilizzando un femore o tutte le ossa lunghe.
1. Prelievo del midollo osseo
NOTA: Per i dettagli sul protocollo di dissezione degli animali, fare riferimento a Amend et al.26.
<ol><li>Pulire il mortaio e il pestello con etanolo al 70%, sciacquarli con tampone FACS refrigerato (Tabella 1) e metterli sul ghiaccio a raffreddare prima di iniziare la raccolta. Inoltre, posizionare il tampone MACs (Tabella 1) sul banco per consentirgli di raggiungere la temperatura ambiente.</li>
	<li>Sopprimere l'animale seguendo le linee guida e i protocolli istituzionali per la cura e l'uso degli animali.</li>
	<li>Sul piano di lavoro, spruzzare accuratamente il topo con etanolo al 70% fino a quando il pelo non è bagnato. Usando una pinza e delle forbici ricurve, sollevare la pelle sull'addome e praticare due incisioni di circa 0,5 mm di lunghezza su entrambi i lati del topo, lateralmente dall'addome. Successivamente, praticare un'incisione di 0,5 mm distale dall'addome. Tirare verso il basso per rimuovere la pelle e il pelo dalle zampe del topo.</li>
	<li>Posizionare le forbici perpendicolarmente al bacino, premere verso il basso mentre si tira verso l'alto il femore con una pinza. La testa del femore dovrebbe staccarsi dal bacino. Separare il femore e la tibia all'articolazione femoro-rotulea. Posizionare le ossa nel tampone FACS in una piastra a 6 pozzetti su ghiaccio.</li>
	<li>Rimuovere il tessuto dalle ossa utilizzando tessuto di laboratorio e posizionare le ossa pulite in una nuova piastra a 6 pozzetti con tampone FACS fresco su ghiaccio.</li>
	<li>Mettere tutte le ossa nel mortaio con 2-5 ml di tampone FACS in modo che tutte le ossa siano immerse nel tampone (regolare il volume del tampone in base al numero di ossa che si stanno lavorando). Schiacciare e macinare le ossa usando il pestello con un movimento circolare fino a quando il tessuto del midollo osseo non viene rilasciato.</li>
	<li>Utilizzando una siringa da 3 ml, omogeneizzare il midollo osseo tirando verso l'alto e sciacquando il liquido dal mortaio.</li>
	<li>Utilizzando una siringa da 3 ml, estrarre il liquido dalla malta e filtrarlo attraverso un colino cellulare da 70 μm in una provetta da 50 mL su ghiaccio. Sciacquare i pezzi di osso/tessuto dal filtro nel mortaio con tampone FACS e tornare al passaggio 1.7 per omogeneizzare e filtrare una seconda volta. Questa costituisce la frazione del midollo osseo.</li>
	<li>Sciacquare i restanti pezzi di osso (spicole) nella malta con tampone FACS e sciacquarli in una provetta da 15 mL utilizzando un tampone FACS per garantire la massima resa cellulare. Questa è la frazione delle spicole ossee.</li>
</ol>2. Digestione del midollo osseo
<ol><li>Centrifugare il midollo osseo a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Decantare e scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere il midollo osseo in 2 mL della miscela per la digestione del midollo osseo (Tabella 1) e trasferirlo in una provetta da 15 mL. Incubare a 37 °C per 45 minuti su un rotatore.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di tampone FACS per arrestare la digestione enzimatica. Filtrare la miscela attraverso un colino cellulare da 70 μm in una nuova provetta da 50 ml.</li>
	<li>Pellet la miscela a 400 x g per 7 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Risospendere il pellet di midollo osseo in 1 mL di tampone di lisi per globuli rossi (vedere Tabella dei materiali). Incubare per 4 minuti con ghiaccio.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di tampone FACS per arrestare la lisi. Filtrare la miscela attraverso un colino cellulare da 70 μm in una nuova provetta da 50 ml.</li>
	<li>Pellet la miscela a 300 x g per 5 min a 4 °C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 100 μL di tampone FACS.</li>
</ol>3. Digestione delle spicole ossee
<ol><li>Vorticare le spicole ossee dal passaggio 1.9 e lasciarle depositare. Decantare il surnatante e trattenere l'osso sul fondo.</li>
	<li>Risospendere le spicole ossee in 1 mL della miscela per la digestione delle spicole ossee (Tabella 1).</li>
	<li>Posizionare i tubi su un rotatore di tubi per 60 minuti a 37 °C.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di tampone FACS per arrestare la digestione enzimatica. Filtrare la miscela attraverso un colino cellulare da 70 μm nella provetta da 50 mL contenente il midollo osseo lisizzato e digerito dai globuli rossi.</li>
</ol>4. Colorazione
<ol><li>Mescolare delicatamente le spicole ossee e la sospensione delle cellule del midollo osseo.</li>
	<li>Utilizzare 10 μL della sospensione cellulare per contare il numero di cellule vive su un emocitometro utilizzando la colorazione a base di blu di tripano allo 0,4%, come descritto nei protocolli pubblicati27. Raccogli 50.000 cellule per un controllo non colorato dalla sospensione cellulare.</li>
	<li>Centrifugare le restanti cellule a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e risospenderlo in 100 μL di tampone FACS. NOTA: Gli anticorpi possono essere titolati per determinare la diluizione ideale. La selezione degli anticorpi (epitopi e fluorocromi) può essere personalizzata.</li>
	<li>Per la colorazione con anticorpi per la deplezione magnetica, aggiungere FC Block (1 μL per 25 x 106 cellule), CD45-APC (10 μL per 25 x 106 cellule) e Ter119-APC (4 μL per 25 x 106 cellule) (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Incubare su ghiaccio per 20 min. Lavare con tampone FACS, rimuovere 50.000 cellule (~50 μL) per il controllo colorato con APC, centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C e risospendere in 100 μL di tampone FACS.</li>
	<li>Per la colorazione della sospensione cellulare con microsfere per la deplezione magnetica, aggiungere mIgG (8 μL per 25 x 106 cellule) e microsfere Anti-APC (20 μL per 25 x 106 cellule) (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Incubare su ghiaccio per 20 min. Lavare con tampone FACS da 10 mL, centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.</li>
</ol>5. Esaurimento del campione mediante cernita magnetica
NOTA: Questa fase viene eseguita utilizzando un separatore magnetico manuale disponibile in commercio secondo le istruzioni del produttore. Questo passaggio può essere eseguito anche con un separatore automatizzato (vedi Tabella dei materiali).
<ol><li>Preparare la colonna LD lavandola con 2 mL di tampone MACs (Tabella 1). Scartare l'effluente e sostituire la provetta di raccolta.</li>
	<li>Risospendere fino a 1 x 108 cellule nel tampone MAC e filtrarle attraverso una provetta da 5 mL con un tappo di filtro da 35 μm.</li>
	<li>Posizionare la colonna LD sul supporto del separatore magnetico. Posizionare una provetta da 5 mL sotto la colonna per raccogliere l'eluato.</li>
	<li>Aggiungere la sospensione cellulare alla colonna LD preparata. Lasciare che la frazione negativa fluisca nella provetta di raccolta. Lavare la colonna due volte con 1 mL di tampone MACs, raccogliendo l'eluato nella stessa provetta. Questa è la frazione negativa utilizzata nel passaggio 5.6 di seguito.</li>
	<li>Rimuovere la colonna LD dal supporto del separatore magnetico e posizionarla su una nuova provetta da 5 mL. Utilizzare una pipetta per erogare 3 mL di tampone nella colonna per eliminare le cellule che sono state marcate positivamente, utilizzando lo stantuffo della colonna.</li>
	<li>Centrifugare le frazioni negativa e positiva a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospenderli in 100 μL di tampone FACS.</li>
	<li>Contare 10 μL delle frazioni negativa e positiva con lo 0,4% di blu di tripano. I volumi per l'osteoanalisi/colorazione del pannello endoteliale di seguito si baseranno su questa conta cellulare.</li>
	<li>Utilizzare 50.000 cellule vive dalla frazione positiva per i controlli di gating della citometria a flusso.</li>
</ol>6. Osteoanalisi/colorazione del pannello endoteliale
NOTA: La compensazione deve essere eseguita seguendo i protocolli standard di citometria a flusso, compresi tutti i controlli appropriati di colorazione e gating.
<ol><li>Per la colorazione della frazione negativa CD45/Ter119 (1 μL di ciascun anticorpo per 1 x 106 cellule), aggiungere CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE e CD140a-PE-Cy5 (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Incubare su ghiaccio per 20 min. Lavare con 2 mL di tampone FACS, quindi centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tampone FACS e una diluizione 1:1000 di PI per la colorazione viva/morta, quindi filtrare il campione attraverso una provetta da 5 mL con un tappo di filtro cellulare da 35 μm.</li>
	<li>Analizza le cellule su un citometro a flusso multicolore.</li>
</ol>

Isolamento e caratterizzazione del microambiente midollare nelle neoplasie mieloidi

<ol>
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Non sono stati dichiarati conflitti di interesse.

I modelli di leucemia murina sono stati ampiamente utilizzati per identificare i segnali cellulari intrinseci e di nicchia che promuovono la progressione della leucemia mieloide aggressiva 6,19,21. Qui, viene presentato un protocollo completo basato sulla citometria a flusso per definire la composizione cellulare del microambiente del midollo osseo in modelli murini di MDS e AML.
Prima di acquisire i ...

Il microambiente del midollo osseo è costituito da cellule ematopoietiche, cellule stromali non ematopoietiche e dalla matrice extracellulare 1,2. Questo microambiente può promuovere l'autorinnovamento delle cellule staminali ematopoietiche, regolare la differenziazione del lignaggio e fornire supporto strutturale e meccanico al tessuto osseo 1,2,3,4,5. La nicchia stromale comprende le cellule dell'osteolignaggio, i fibroblasti, le cellule nervose e le cellule endoteliali6, mentre la nicchia ematopoietica è costituita dalle popolazioni linfoidi e mieloidi 1,2,3. Oltre a supportare le normali HSC, il microambiente del midollo osseo può anche svolgere un ruolo nello sviluppo di malattie delle cellule staminali ematopoietiche come MDS e LMA 7,8,9,10,11. È stato dimostrato che le mutazioni nelle cellule osteolignaggi promuovono lo sviluppo di MDS, LMA e altre neoplasie mieloproliferative 10,12,13,14.
Le sindromi mielodisplastiche sono un gruppo di malattie preleucemiche che derivano da mutazioni nelle cellule staminali ematopoietiche. La MDS è spesso associata a un blocco della differenziazione delle HSC e alla produzione di cellule displastiche, che spesso possono portare a insufficienza del midollo osseo. La MDS è la neoplasia mieloide più comunemente diagnosticata negli Stati Uniti ed è associata a un tasso di sopravvivenza a 3 anni del 35%-45%15. La MDS è spesso associata a un alto rischio di trasformazione in leucemia mieloide acuta. Questa può essere una complicanza fatale, poiché la LMA derivata da MDS è resistente alla maggior parte delle terapie e può recidiva. Anche la LMA che insorge de novo a causa di traslocazioni o mutazioni nel tronco ematopoietico e nei progenitori è spesso resistente alla chemioterapia standard16,17. Poiché le MDS e la LMA sono principalmente malattie degli anziani, con la maggior parte diagnosticate oltre i 60 anni, la maggior parte dei pazienti non è idonea per i trapianti curativi di midollo osseo. C'è, quindi, una significativa necessità di identificare nuovi regolatori della progressione della malattia. Poiché il microambiente del midollo osseo può fornire supporto alle cellule maligne14, la definizione dei cambiamenti nella nicchia del midollo osseo con progressione della malattia può portare all'identificazione di nuove terapie volte a inibire il rimodellamento della nicchia tumorale. C'è, quindi, una significativa necessità di identificare nuovi regolatori della progressione della malattia. A tal fine, è fondamentale identificare e caratterizzare i cambiamenti nelle popolazioni di cellule stromali del midollo osseo che possono fornire supporto alle cellule maligne.
Sono stati generati diversi modelli murini di LMA e MDS che possono essere utilizzati per studiare i cambiamenti nel microambiente del midollo osseo durante l'inizio e la progressione della malattia 6,1,19,20,21,22. Qui, vengono descritti i protocolli per identificare i cambiamenti nelle popolazioni di cellule stromali del midollo osseo utilizzando modelli murini di LMA 6,20 indotta da retrovirale, nonché il modello Nup98-HoxD13 (NHD13) disponibile in commercio di MDS ad alto rischio in trasformazioneAML 19. I topi trapiantati con cellule di LMA de novo soccombono alla malattia in 20-30 giorni6. I topi NHD13 sviluppano citopenie e displasia del midollo osseo intorno alle 15-20 settimane, che alla fine si trasformano in LMA, e quasi il 75% dei topi soccombe alla malattia intorno alle 32 settimane. Per analizzare le popolazioni del microambiente del midollo osseo modello murino, le ossa vengono prelevate, il midollo osseo e le spicole ossee vengono digeriti utilizzando la digestione enzimatica e le cellule vengono quindi arricchite per le popolazioni non ematopoietiche CD45-/Ter119- mediante ordinamento magnetico. Sebbene analisi simili siano state descritte in precedenza 11,13,22,23,24,25, spesso si concentrano sul midollo osseo o sull'osso e non incorporano cellule provenienti da entrambe le fonti nelle loro analisi. La caratterizzazione combinata di queste popolazioni, in combinazione con le analisi dell'espressione genica, può fornire una comprensione completa di come il microambiente ematopoietico cellulare fornisca supporto per l'inizio e la progressione della malattia (Figura 1). Mentre il protocollo descritto di seguito si concentra sul modello di LMA indotto retroviralmente e su un modello genetico di MDS, queste strategie possono essere facilmente adattate per studiare i cambiamenti nella nicchia del midollo osseo di qualsiasi modello murino di interesse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL pipette Tips&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>24-165RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>AVANT</td>
			<td>L211511-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L pipette Tips</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>24-140RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes</td>
			<td>Globe scientific</td>
			<td>1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Vacuum Filtration Flask</td>
			<td>NEST</td>
			<td>344021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10026-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Aspirating Pipette</td>
			<td>NEST</td>
			<td>325011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette Tips</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>24-150-RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes</td>
			<td>Globe scientific</td>
			<td>1780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes</td>
			<td>Globe scientific</td>
			<td>1740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube&#160; 12 x 75 mm style</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56616-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi&#160;</td>
			<td>130-090-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>4425745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>0.5 mg/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>66.000 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>404-5981</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J Mice</td>
			<td>Jackson Laboratory&#160;</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Dioxide Gas Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25-0311-82</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17-0451-82</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 70 &#181;m Nylon&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-63100-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>7415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Mini Centrifuge</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>6770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Stripettor Ultra Pipet Controller</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>117105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10x</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14200-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience 1x RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors - sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foundation B Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>900-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson&#160;PIPETMAN L Pipette Starter Kits</td>
			<td>FisherScientific&#160;</td>
			<td>F167370G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) 10x</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-671-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>BINDER</td>
			<td>C150-UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KIMTECH</td>
			<td>K222101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-425-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSE Vortex Mixer</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>6775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRII/Fortessa/Symphony A1</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>647800L6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MULTI STAND&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACsmix Tube Rotator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mIgG</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>18765-10mg</td>
			<td>2 mg/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice</td>
			<td>Jackson Laboratory&#160;</td>
			<td>010505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>104106</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135920</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastipak 3 mL Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS&#160; Separator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>75009521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17-5921-82</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying bone marrow microenvironmental populations in myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia

Il microambiente del midollo osseo è costituito da popolazioni cellulari distinte, come le cellule stromali mesenchimali, le cellule endoteliali, le cellule osteolignaggio e i fibroblasti, che forniscono supporto alle cellule staminali ematopoietiche (HSC). Oltre a supportare le normali HSC, il microambiente del midollo osseo svolge anche un ruolo nello sviluppo di malattie delle cellule staminali ematopoietiche, come le sindromi mielodisplastiche (MDS) e la leucemia mieloide acuta (LMA). Le mutazioni associate alle MDS nelle HSC portano a un blocco della differenziazione e a una progressiva insufficienza del midollo osseo, soprattutto negli anziani. Le MDS possono spesso progredire verso la LMA resistente alla terapia, una malattia caratterizzata da un rapido accumulo di blasti mieloidi immaturi. È noto che il microambiente del midollo osseo è alterato nei pazienti con queste neoplasie mieloidi. Qui viene descritto un protocollo completo per isolare e caratterizzare fenotipicamente le cellule microambientali del midollo osseo da modelli murini di sindrome mielodisplastica e leucemia mieloide acuta. L'isolamento e la caratterizzazione dei cambiamenti nelle popolazioni di nicchia del midollo osseo può aiutare a determinare il loro ruolo nell'inizio e nella progressione della malattia e può portare allo sviluppo di nuove terapie mirate alle alterazioni che promuovono il cancro nelle popolazioni stromali del midollo osseo.

The bone marrow microenvironment consists of hematopoietic cells, non-hematopoietic stromal cells, and the extracellular matrix1,2. This microenvironment can promote hematopoietic stem cell self-renewal, regulate lineage differentiation, and provide structural and mechanical support to the bone tissue1,2,3,4,5. The stromal niche includes osteolineage cells, fibroblasts, nerve cells, and endothelial cells6, while the hematopoietic niche consists of the lymphoid and myeloid populations1,2,3. In addition to supporting normal HSCs, the bone marrow microenvironment can also play a role in the development of hematopoietic stem cell disorders such as MDS and AML7,8,9,10,11. Mutations in osteolineage cells have been shown to promote the development of MDS, AML, and other myeloproliferative neoplasms10,12,13,14.
Myelodysplastic syndromes are a group of pre-leukemic disorders that arise from mutations in hematopoietic stem cells. MDS is frequently associated with a block in HSC differentiation and the production of dysplastic cells, which can often lead to bone marrow failure. MDS is the most commonly diagnosed myeloid neoplasm in the United States and is associated with a 3-year survival rate of 35%-45%15. MDS is often associated with a high risk of transformation to acute myeloid leukemia. This can be a fatal complication, as MDS-derived AML is resistant to most therapies and likely to relapse. AML that arises de novo due to translocations or mutations in hematopoietic stem and progenitors is also often resistant to standard chemotherapy16,17. Since MDS and AML are primarily diseases of the elderly, with the majority diagnosed over the age of 60 years, most patients are ineligible for curative bone marrow transplants. There is, thus, a significant need to identify novel regulators of disease progression. Since the bone marrow microenvironment can provide support for malignant cells14, defining changes in the bone marrow niche with disease progression may lead to the identification of novel therapeutics aimed at inhibiting tumor niche remodeling. There is, therefore, a significant need to identify novel regulators of disease progression. To this end, it is critical to identify and characterize changes in the bone marrow stromal cell populations that may provide support for the malignant cells.
Several murine models of AML and MDS have been generated and can be used to study changes in the bone marrow microenvironment during disease initiation and progression6,1,19,20,21,22. Here, protocols to identify changes in the bone marrow stromal cell populations using murine models of retrovirally induced AML6,20, as well as the commercially available Nup98-HoxD13 (NHD13) model of high-risk MDS to AML transformation19, are described. Mice transplanted with de novo AML cells succumb to the disease in 20-30 days6. The NHD13 mice develop cytopenias and bone marrow dysplasia around 15-20 weeks, which eventually transforms into AML, and nearly 75% of the mice succumb to the disease around 32 weeks. To analyze the murine model bone marrow microenvironment populations, bones are harvested, bone marrow and bone spicules are digested using enzymatic digestion, and the cells are then enriched for CD45-/Ter119- non-hematopoietic populations by magnetic sorting. While similar analyses have been previously described11,13,22,23,24,25, they often focus on either the bone marrow or the bone and do not incorporate cells from both sources in their analyses. The combined characterization of these populations, in conjunction with gene expression analyses, can provide a comprehensive understanding of how the cellular hematopoietic microenvironment provides support for disease initiation and progression (Figure 1). While the protocol described below focuses on retrovirally induced AML model and a genetic MDS model, these strategies can be easily adapted to study changes in the bone marrow niche of any murine model of interest.

Autore in primo piano: Analisi del microambiente del midollo osseo nelle neoplasie ematologiche murine 

Identificazione delle popolazioni microambientali del midollo osseo nella sindrome mielodisplastica e nella leucemia mieloide acuta

Our research aims to explore how the bone marrow's changing environment influences tumor growth. We developed a flow cytometry protocol to analyze the non-immune cells in bone marrow and bone tissues, focusing on murine hematological malignancies. This method is adaptable for studying bone marrow in various murine models.Our study focuses on isolating and identifying alterations in bone marrow stromal populations during cancer progression. Understanding their impact on disease onset and advancement could pave the way for new treatments that target these cancer-facilitating changes in the bone marrow stromal cells. Our protocol uniquely combines mechanical and enzymatic digestions, magnetic depletions, and flow cytometry to delineate the bone marrow microenvironment cellular makeup.It stands out by employing magnetic separation and incorporating cells from both bone and marrow, offering a more comprehensive representation of this microenvironment.

Questo articolo descrive un metodo basato sulla citometria a flusso per l'analisi delle popolazioni microambientali del midollo osseo, come le cellule stromali endoteliali e mesenchimali, da modelli murini di MDS e leucemia (Figura 1). La Figura 2 illustra la strategia di gating per l'individuazione delle popolazioni di interesse, a partire dalla selezione delle cellule (P1) nella frazione digerita e depleta di CD45/Ter119 attraverso il profilo di scatter dirett...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Bone Marrow Microenvironment in Murine Hematological Malignancies at JoVE.com

Qui viene presentato un protocollo dettagliato per isolare e caratterizzare le popolazioni microambientali del midollo osseo da modelli murini di sindromi mielodisplastiche e leucemia mieloide acuta. Questa tecnica identifica i cambiamenti nella nicchia del midollo osseo non ematopoietico, comprese le cellule stromali endoteliali e mesenchimali, con progressione della malattia.

The bone marrow microenvironment consists of distinct cell populations, such as mesenchymal stromal cells, endothelial cells, osteolineage cells, and ...

La nostra ricerca mira a esplorare come l'ambiente mutevole del midollo osseo influenzi la crescita del tumore. Abbiamo sviluppato un protocollo di citometria a flusso per analizzare le cellule non immunitarie nel midollo osseo e nei tessuti ossei, concentrandoci sulle neoplasie ematologiche murine. Questo metodo è adattabile per lo studio del midollo osseo in vari modelli murini.Il nostro studio si concentra sull'isolamento e l'identificazione delle alterazioni nelle popolazioni stromali del midollo osseo durante la progressione del cancro. Comprendere il loro impatto sull'insorgenza e sull'avanzamento della malattia potrebbe aprire la strada a nuovi trattamenti mirati a questi cambiamenti che facilitano il cancro nelle cellule stromali del midollo osseo. Il nostro protocollo combina in modo univoco digestioni meccaniche ed enzimatiche, deplezioni magnetiche e citometria a flusso per delineare la composizione cellulare del microambiente del midollo osseo.Si distingue per l'impiego della separazione magnetica e l'incorporazione di cellule sia ossee che midollari, offrendo una rappresentazione più completa di questo microambiente.

identifying-bone-marrow-microenvironmental-populations

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Identifying Bone Marrow Microenvironmental Populations in Myelodysplastic Syndrome and Acute Myeloid Leukemia

797 Views.  University of Rochester Medical Center. La nostra ricerca mira a esplorare come l'ambiente mutevole del midollo osseo influenzi la crescita del tumore. Abbiamo sviluppato un protocollo di citometria a flusso per analizzare le cellule non immunitarie nel midollo osseo e nei tessuti ossei, concentrandoci sulle neoplasie ematologiche murine. Questo metodo è adattabile per lo studio del midollo osseo in vari modelli murini.Il nostro studio si concentra sull'isolamento e l'identificazione delle alterazioni nelle popolazioni stro...

Video: Autore in primo piano: Analisi del microambiente del midollo osseo nelle neoplasie ematologiche murine 

The bone marrow microenvironment consists of distinct cell populations, such as mesenchymal stromal cells, endothelial cells, osteolineage cells, and fibroblasts, which provide support for hematopoietic stem cells (HSCs). In addition to supporting normal HSCs, the bone marrow microenvironment also plays a role in the development of hematopoietic stem cell disorders, such as myelodysplastic syndromes (MDS) and acute myeloid leukemia (AML). MDS-associated mutations in HSCs lead to a block in differentiation and progressive bone marrow failure, especially in the elderly. MDS can often progress to therapy-resistant AML, a disease characterized by a rapid accumulation of immature myeloid blasts. The bone marrow microenvironment is known to be altered in patients with these myeloid neoplasms. Here, a comprehensive protocol to isolate and phenotypically characterize bone marrow microenvironmental cells from murine models of myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia is described. Isolating and characterizing changes in the bone marrow niche populations can help determine their role in disease initiation and progression and may lead to the development of novel therapeutics targeting cancer-promoting alterations in the bone marrow stromal populations.

Here a detailed protocol to isolate and characterize bone marrow microenvironmental populations from murine models of myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia is presented. This technique identifies changes in the non-hematopoietic bone marrow niche, including the endothelial and mesenchymal stromal cells, with disease progression.

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Murine Bone Marrow Harvest and Isolation for the Characterization of Myeloid Leukemia Microenvironment 

To begin, remove the tissue from the bones of the euthanized dissected mouse. Place the cleaned bones into a new six-well plate containing FACS buffer placed on ice. Transfer the bones into a mortar with two to five milliliters of FACS buffer.Grind the bones in a circular motion until the bone marrow is released. With a three milliliter syringe, pull up and flush down the bone marrow to homogenize it. Pull the homogenate into another syringe, then filter it through a 70 micrometer cell strainer into a 50 milliliter tube.Rinse the tissue chunks from their filter back into the mortar with FACS buffer before homogenizing a second time. Filter the rinsed tissue as before. Next, rinse the remaining bone spicules back into the mortar with FACS buffer.Then flush the pieces into a 15 milliliter tube to ensure maximum yield. To digest the bone marrow, first centrifuge it at 300 G for five minutes at four degrees Celsius. Resuspend the bone marrow pellet in two milliliters of digestion mixture.Transfer the mixture to a 15 milliliter tube. Then incubate it at 37 degrees Celsius for 45 minutes on a rotator. Now, add 10 milliliters of FACS buffer to stop the enzymatic digestion.Filter the mixture through a 70 micrometer cell strainer into a 50 milliliter tube. Centrifuge the suspension at 400 G for seven minutes at four degrees Celsius. Resuspend the pellet in one milliliter of RBC lysis buffer.Next, add 10 milliliters of FACS buffer to halt the lysis. Then filter the mixture as before into a 50 milliliter tube. Lastly, centrifuge the mixture at 300 G for five minutes at four degrees celsius.After discarding the supernatant, resuspend the pellet in 100 microliters of FACS buffer. For the digestion of bone spicules, first, vortex the bone spicules. Decant the supernatant and retain the bones at the bottom.Next, resuspend the spicules in one milliliter of the bone spicule digestion mixture. Incubate the tube on a rotator for 60 minutes at 37 degrees Celsius. Finally, stop the digestion with 10 milliliters of FACS buffer.Filter the mixture into the 50 milliliter tube containing RBC lysed and digested bone marrow.

Prelievo e isolamento del midollo osseo murino per la caratterizzazione del microambiente della leucemia mieloide 

Murine Bone Marrow Staining for the Characterization of Myeloid Leukemia Microenvironment

To begin, mix the isolated murine bone marrow suspension with the bone spicule suspension. Pipette 10 microliters of the cell suspension onto a hemocytometer for counting. Centrifuge the cell suspension at 300 G for five minutes at four degrees Celsius.Then resuspend the pellet in 100 microliters of FACS buffer. To stain the cells with antibodies for magnetic depletion, add FC block, CD45 APC, and TER-119 APC. Then wash the cell suspension with FACS buffer.After centrifuging the remaining mixture, resuspend the pellet in 100 microliters of FACS buffer. To stain the cell suspension with microbeads for magnetic depletion, add mouse IgG and anti-APC microbeads. Incubate the mixture on ice for 20 minutes.Wash the LD column with two milliliters of MACS buffer. Resuspend the cells in the buffer, then filter it through a five milliliter test tube with a 35 micrometer cell strainer cap. Next, set the LD column on the magnetic separator stand and place a five milliliter test tube under the column to collect the eluted material.Pipette the cell suspension into the LD column and collect the negative fraction flow through in the test tube. Wash the column two times with one milliliter of MACS buffer and collect the eluent material in the same tube. Place the LD column over a new five milliliter test tube.With a pipette, dispense three milliliters of buffer into the column, then flush out the positively labeled cells into a five milliliter test tube. Centrifuge both the positive and negative fractions, then resuspend the pellet in 100 microliters of FACS buffer. To stain the CD45 TER-119 negative fraction add one microliter of each antibody for every 10 to the sixth cells.Place the suspension on ice for 20 minutes. Then wash the suspension with two milliliters of FACS buffer before centrifuging. Add one milliliter of the buffer to the pellet and pipette propidium iodide for live cell staining.Finally, filter the sample through a 35 micrometer cell strainer into a five milliliter test tube before analyzing the cells on a multicolor flow cytometer. Arteriolar endothelial cells significantly expanded in the acute myeloid leukemia microenvironment with a concomitant loss in the sinusoidal endothelial populations. A small expansion in the mesenchymal stromal cells were seen at eight weeks of age.