Il nostro protocollo descrive come tecniche come i saggi pull-down la cromatografia analitica di esclusione delle dimensioni, l'ultra-centrifugazione analitica e il test di chaperoning degli istoni potrebbero essere utilizzate per confermare se una proteina è un chaperone istonico. Le tecniche trattate qui, quando si utilizza il tandem, potrebbero essere applicate direttamente per caratterizzare un presunto accompagnatore. Il suo potrebbe andare d'accordo con la tecnica della biologia strutturale.
Le tecniche sono applicabili al campo della ricerca sulla cromatina. Tuttavia, i singoli metodi potrebbero essere applicati a qualsiasi altra proteina di interesse, se necessario. A dimostrare la procedura sarà il signor Surajit Gandhi, uno studente di dottorato del mio laboratorio, per il complicato test di pull-down;
Archana Samal, uno studente di dottorato, insieme a Mr.Ruchir C.Bobde per l'esperimento analitico di ultra-centrifugazione;Mr. Somanath Baral, uno studente di dottorato;insieme a Mr.Ketul Saharan per il test di super-avvolgimento plasmidico In primo luogo, mescolare chaperoni di istone a cinque micromolari con dimeri H2A / H2B da 20 micromolari in 300 microlitri di tampone di equilibrio. Centrifugare il complesso H2A/H2B dell'istone chaperone per rimuovere qualsiasi precipitato.
Caricate il campione sulla colonna di spin prebilanciata con buffer di bilanciamento. Lavare la colonna con 100 volumi di colonna o quattro millilitri di tampone di lavaggio per rimuovere il dimero H2A / H2B in eccesso. Quindi, mescolare il complesso H2A / H2B chaperone dell'istone con 20-60 micromolari H3 / H4 tetramero.
Rilavare la colonna con 100 volumi di colonna o quattro millilitri di tampone di lavaggio per rimuovere qualsiasi tetramero H3/H4 non legato, quindi eluire i campioni con tampone di eluizione. Sottoporre i campioni eluiti al 18% SDS-PAGE. Quindi, colorare con Coomassie blu brillante R250 e visualizzare il gel.
Purificare il dimero H2A/H2B, il tetramero H3/H4 nello chaperone istonico singolarmente con il tampone di dialisi utilizzando la cromatografia analitica di esclusione dimensionale. Salvare il buffer dall'esecuzione per preparare ulteriori diluizioni in seguito e utilizzarlo come riferimento nella cella AUC. Per i campioni di AUC, mescolare gli chaperoni purificati con dimero o tetramero in provette separate fino a un volume finale di 450 microlitri utilizzando il tampone di dialisi salvato per raggiungere un OD280 compreso tra 0,3 e 0,6.
Montare la cella con un centrotavola a doppio settore e finestre al quarzo dotate di un'ultracentrifuga analitica con rilevatore di assorbanza. Riempire 400 microlitri della soluzione del campione e 420 microlitri di tampone per dialisi rispettivamente nei settori di riferimento e campione della cella. Pesare e bilanciare accuratamente le celle e caricarle in un rotore in titanio a quattro fori.
Allineare le celle utilizzando i segni nella parte inferiore delle celle e del rotore. Caricare il rotore nella centrifuga, chiudere il coperchio e avviare la corsa, che consente lo sviluppo di un vuoto e la stabilizzazione della temperatura. Per l'analisi dei dati, calcolare la densità e la viscosità per i componenti tampone delle proteine e il volume specifico parziale in base alla composizione aminoacidica della proteina utilizzando il programma SEDNTERP.
Caricare i dati dalla macchina AUC nel programma SEDFIT. Definire il menisco, la linea rossa, la parte inferiore della cella, la linea blu e i limiti dell'analisi dei dati linee verdi. Scegliete Distribuzione CS continua come modello.
Nella sezione parametri, impostare la risoluzione massima fino a 100. Quindi, impostare il coefficiente di sedimentazione minimo a zero e massimo a 10-15. Impostare inizialmente il rapporto di attrito su 1,2 e scegliere di float per derivare il rapporto dai dati.
Impostare il rapporto F su 0,68 per la regolarizzazione di un sigma. Impostare il volume specifico parziale, la densità del tampone e la viscosità ottenuti dal SEDNTURP. Premere Esegui per consentire al software di risolvere l'equazione lam.
Premere Adatta per perfezionare. Selezionate Mostra picco Mw in CS nella funzione di visualizzazione della barra degli strumenti principale per stimare le masse molecolari. Mescolare il tetramero H3/H4 a due micromolari e il dimero H2A/H2B a quattro micromolari con concentrazioni crescenti di chaperone istonico, che vanno da uno a sei micromolari, in un tampone di assemblaggio fino a un volume finale di 50 microlitri.
Incubare la miscela a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Contemporaneamente, pretrattare 500 nanogrammi del plasmide PUC-19 super-arrotolato negativamente con un microgrammo di enzima topoisomerasi I nel tampone di assemblaggio in un volume finale a 50 microlitri. Quindi, combinare la soluzione premiscelata contenente tetramero, dimero e chaperone istonico con il DNA plasmatico rilassato.
Aggiungere 100 microlitri di tampone di arresto 2X e incubare per terminare la reazione di assemblaggio deproteinizzando il DNA plasmide. Aggiungere un volume uguale di fenolo Tris-saturo nel tubo contenente la miscela di reazione e mescolare bene il contenuto della miscela di reazione. Quindi, centrifugare il campione.
Raccogliere delicatamente la fase acquosa superiore contenente il DNA plasmidico con una micropipetta e mescolare un volume uguale di cloroformio. Vortice la miscela. Quindi, raccogliere la fase acquosa superiore, aggiungere un volume 1/10 di acetato di sodio a tre molari di pH 5,5 e 2,5 volumi di etanolo ghiacciato.
Mescolare bene la soluzione invertendo il tubo tre o quattro volte. Centrifugare il campione a 16, 200 G per 10 minuti e scartare delicatamente il surnatante. Tenere i tubi aperti a temperatura ambiente fino a quando anche tracce di etanolo evaporano, lasciando il DNA plasmidico precipitato nel tubo.
I risultati analitici della SEC hanno rivelato che il dominio nucleoplasmina N-terminale ricombinante della proteina Arabidopsis thaliana FKBP53 è un pentamero di 65 kilodalton in soluzione. Il campione di nucleoplasmina sottoposto a trattamento termico ha mostrato che il dominio è altamente termostabile. Il dominio della nucleoplasmina mostrava stabilità salina fino a due molari di cloruro di sodio e stabilità dell'urea fino a quattro molari.
Un test a pull-down ha rivelato che l'interazione del dominio nucleoplasmina con dimero H2A / H2B era stabile fino a cloruro di sodio 0,4 molari, mentre l'associazione con H3 / H4 era stabile fino a 0,7 molari. Lo chaperone lega simultaneamente il dimero H2A/H2B e il tetramero H3/H4, indipendentemente dall'ordine in cui vengono aggiunti allo chaperone, indicando siti di interazione separati per gli oligomeri. Le masse molecolari stimate attraverso AUC-SV rivelano una stechiometria 1:1 del dominio nucleoplasmina con gli oligomeri istonici.
Nel test del super-avvolgimento plasmide, gli chaperoni degli istoni vegetali ricombinanti AtNRP1 e AtNRP2 hanno aumentato la quantità di plasmide super-arrotolato, suggerendo che potrebbe depositare istoni sul DNA per formare nucleosomi, causando il super avvolgimento del DNA. Il saggio plasmidico super-avvolgimento richiede particolare cura e possibile ottimizzazione per la caratterizzazione del DNA istonico e del chaperone. La telemetria di caratterizzazione isomerica può essere utilizzata come follow-up di esperimenti analitici di esclusione dimensionale per confermare la stabilità del legame.
