Abbiamo costruito un test omogeneo basato su perle per studiare le interazioni chaperone-cochaperone. Usando questa tecnica, vastiamo a screening piccole molecole che inibiscono le interazioni tra Hsp90 e FKDP51 o FKBP52 e identifichiamo inibitori potenti e selettivi. Questa tecnica di screening ad alta produttività è robusta e affidabile.
I risultati possono essere ottenuti entro un'ora e richiede solo piccole quantità di proteine e composti di perle. L'interazione di Hsp90 con questi cochaperones è stata implicata in disturbi umani, come il morbo di Alzheimer, il cancro, la malattia autoimmune. Questa tecnica offre l'opportunità di schermare gli inibitori chaperone-cochaperone con elevata importanza medica.
Ecco il principio di base di questo test. Quando l'interazione tra il peptide Hsp90C-terminale e il dominio TPR dei cochaperones porta le perle del donatore e dell'accettore in prossimità, viene generato un segnale altamente amplificato. Quando vengono aggiunti gli inibitori dell'interazione, le perle del donatore e dell'accettore non possono raggiungere la prossimità e non viene prodotto alcun segnale rilevabile.
Iniziare diluendo il peptide Hsp90 in PBS a una concentrazione di milligrammo per millilitro. Diluire le perle accettori non coniugate in PBS e trasferire le perle in un tubo da 1,5 millilitro. Centrifugare le perle diluite per il lavaggio, quindi rimuovere con cura il surnatante.
Per coniugare, impostare le perle accettori in peptidi in un rapporto di 10 a 1. Alle perle paletidiche al peptide diluito PBS, alla soluzione di Tween 20 e sodio cyanaboroughhydride e incubare con agitazione end over end su uno shaker rotativo. Per bloccare i siti non reazionati, aggiungere 20 microlitri di una soluzione molare di Tris cloridrato di pH 8,0 alle perline e spegnere la reazione incubando per un'ora a 37 gradi Celsius.
Al termine dell'incubazione, lavare le perle mediante centrifugazione e sospendere di sospendere il pellet di perle in un millilitro di soluzione di tris cloridrato. Ripetere il lavaggio altre due volte. Dopo l'ultimo lavaggio, sospendere di sospendere le perle a una concentrazione di milligrammi per millilitro nel tampone di stoccaggio e conservare la soluzione di perle accettore coniugata a 4 gradi Celsius al riparo dalla luce.
Aggiungere pere donatrici di glutatione a 10 microgrammi per millilitro di concentrazione in PBS. Aggiungere GSTFKBP51 a una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro e incubare la reazione per 10 minuti a 25 gradi Celsius al buio. Effettuare diluizioni seriali del composto di prova in DMSO.
Aggiungere 0,25 microlitri di diluizioni composte di prova e triplicare nell'angolo di ciascun pozzetti di una piastra da 384 pozzetti. Per il controllo negativo, aggiungere 0,25 microlitri di DMSO e per il controllo positivo, aggiungere 0,25 microlitri di peptide Hsp90 C-Terminal nei pozzetti. Aggiungere 22,5 microlitri della soluzione contenente pere donatrici di glutatione con proteine marcate GST a ciascun pozzo.
Agitare accuratamente il piatto con le mani e incubare al buio a 25 gradi Celsius per 15 minuti. Diluire le perle accettori con il peptide Hsp90C-terminale collegato a 100 microgrammi per millilitro di concentrazione in 0,5 volte PBS. Aggiungere 2,25 microlitri di perle accettori diluite a ciascun pozzo.
Agitare e incubare la piastra al buio per 15 minuti come dimostrato. Accendere lo strumento del lettore di lastre, misurare il segnale della piastra e analizzare i dati come descritto nel manoscritto di testo. Creare una tabella dati X-Y nella finestra di dialogo di benvenuto, selezionare Numeri X, Y e immettere tre valori di replica nelle colonne affiancate.
Importare i valori di concentrazione nella colonna X e i valori del segnale nella colonna Y. Fare clic su Analizza, selezionare Trasforma concentrazione X, quindi selezionare Trasforma in logaritmi. Fare clic su Analizza e scegliere regressione non lineare in Analisi X-Y.
Aprire l'opzione di inibizione della risposta alla dose e scegliere l'equazione della pendenza variabile log versus response. Fare clic su OK per visualizzare i risultati contenenti il valore IC50 e i grafici. Questo test è stato utilizzato per lo screening di piccole molecole, inibendo le interazioni tra Hsp90 e FKBP51 o FKBP52.
Il punteggio Z superiore a 0,8 e il rapporto segnale/background di 13,35 dimostrano la robustezza e l'affidabilità per uno screening ad alto throughput. È stato valutato l'effetto del composto di prova di piccolo peso molecolare D10 sull'inibizione delle interazioni chaperone-cochaperone e sono stati calcolati i valori IC50, dove D10 ha mostrato un'inibizione dose-dipendente. Il valore IC50 per le interazioni Hsp90 GSTFKBP51 era di 65 nanomolari.
Mentre per le interazioni Hsp90, GSTFKBP52, l'inibizione completa non è stata raggiunta con la più alta concentrazione di composti indica che è possibile ottenere l'inibizione selettiva dell'interazione proteina-proteina con piccole molecole. Il passo critico è l'ordine di aggiunta. Per prima cosa formiamo un complesso tra una piccola molecola e il suo bersaglio TPR.
Altrimenti sono necessarie un'incubazione più lunga e concentrazioni di composti più elevate. Possiamo usare questa tecnica per lo screening di piccole molecole che interrompono l'interazione tra Hsp90 e FKB51 o Hsp90 e FKB52. Può anche essere esteso a qualsiasi interazione tra Hsp90, Hsp70 e un motivo TPR contenente inibitori selettivi dello screening del cochaperone.
