We acknowledge Stephanie Gorgeard, Thierry Scheerlink (Toshiba France), and Christophe Lazare (Bracco France).

NOTA: I metodi descritti in questo manoscritto sono stati approvati dal Comitato di Bioetica della Facoltà di Medicina Lariboisière, Parigi, Francia (CEEALV / 2011-08-01). 1. Strumento Preparazione <ol><li> Preparare e pulire i seguenti strumenti per l&#39;inserimento del catetere: micro pinze, micro-forbici, pinza micro-vascolare, grandi forbici, filo chirurgico (intrecciata nero di seta 4-0) e un catetere 14 G. Eparinizzare il catetere con una soluzione di eparina (5.000 U / ml). </li><li> Preparare e pulire i seguenti strumenti per la laminectomia: grandi forbici, bisturi e un cutter osso. Eseguire laminectomia con un cutter osso misura progettato per ridurre il rischio di danneggiare il midollo spinale durante la laminectomia (Figura 1). </li><li> Set-up 3D-telaio utilizzato per il posizionamento e la stabilizzazione dell&#39;animale. Il telaio su misura è costruito con gli elementi di un fissatore esterno Hoffman 3 in collaborazione con pinze, which è stato curvato in modo da adattarsi alla colonna lombare dell&#39;animale. </li><li> Preparare il dispositivo peso-drop (urto) utilizzato per lesioni del midollo spinale biomeccanico. NOTA: Il dispositivo di occlusione su misura è stato progettato con un software 3D e stampata in 3D. </li><li> Accendere la macchina ad ultrasuoni. </li><li> Preparare il kit per la ricostituzione del mezzo di contrasto. NOTA: Il kit comprende 1 flaconcino contenente 25 mg di polvere liofilizzata, siringa 1 pre-riempita contenente 5 ml di cloruro di sodio e un sistema di trasferimento mini-spike (Figura 2). I passi per la ricostituzione del mezzo di contrasto sono riportate di seguito (nella sezione 5). </li></ol> 2. Vena giugulare cateterizzazione (Figura 3) <ol><li> Anestetizzare l&#39;animale con il 4% isoflurano. Posto l&#39;animale in posizione supina. Verificare il corretto anestesia facendo in modo che l&#39;animale non risponde quando le zampe sono schiacciati con una pinza. Applicare veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza mentre under anestesia. </li><li> Radere al collo e pulire la pelle. Fare un&#39;incisione sulla linea mediana del collo. Ritrarre il muscolo sternocleidomastoidian al fine di trovare la vena giugulare interna. Stringere una legatura nella parte rostrale della vena. </li><li> Applicare un morsetto microvascolare sulla vena, 1 cm sotto la legatura. Far passare un altro filo intorno alla vena, appena sotto la fascetta con il nodo pronto per essere stringere quando il morsetto viene rilasciato. </li><li> Aprire la parete della vena (venotomia) tra il morsetto e la legatura rostrale. Introdurre un catetere 14 G nel lume della vena e spingerlo verso il cuore. </li><li> Quando si tratta contro il morsetto, rilasciare quest&#39;ultimo e spingere il catetere. Fissare il catetere nella vena, stringendo troppo il nodo sulla vena con il catetere all&#39;interno. </li><li> Valutare pervietà del catetere prelevando una piccola quantità di sangue venoso nel catetere e successivamente poi risciacquo con soluzione salina eparinizzata. Questo impedisce l&#39;ostruzione del catheter da un potenziale coagulo di sangue. </li><li> Collegare il tubo flessibile per il catetere per l&#39;ulteriore iniezione di mezzo di contrasto (microbolle). Keep it chiuso (sigillato) fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 3. Accesso alla colonna vertebrale, Laminectomy e Rat Posizionamento (in 3D-frame) <ol><li> Posto l&#39;animale in posizione orizzontale prona piatta. Shave e pulire la parte posteriore (regione toracica) dell&#39;animale. </li><li> Identificare l&#39;ultima costola (XIII nel ratto) mediante palpazione (Figura 4). Questo permette di stimare la posizione della vertebra toracica XIII (ThXIII). </li><li> Effettuare una incisione cutanea 4 centimetri sulla linea mediana, centrata sulla ThXIII. Aprire l&#39;incisione cutanea, nonché la borsa sottostante. Osservare il aponeurosi dei muscoli della schiena, così come le punte dei processi colonna vertebrale vertebrali. </li><li> Localizzare con attenzione il processo di colonna vertebrale ThXIII palpando le costole XIII. NOTA: La nervatura XIII è collegato a ThXIII e rappresenta quindi un facile da locate punto di riferimento anatomico per l&#39;identificazione di ThXIII. Questa fase consente la localizzazione del ThXII per Thix processo spinoso e L1 e L2 (primo e secondo vertebre lombari). </li><li> Tagliare il aponeurosi muscolare e staccare i muscoli su entrambi i lati per esporre i processi spinosi, le lamine e le faccette articolari da Thix a L2. Esporre gli aspetti laterali di L1 e L2 staccando muscoli dai processi trasversali. </li><li> Agganciare incisivi dell&#39;animale sul 3D-frame per fissare la posizione (figura 5). Bloccare le vertebre L1 e L2 con le pinze modificati. Collegare la pinza modificati al 3D-frame al fine di stabilizzare l&#39;animale. </li><li> Tirare delicatamente caudale le pinze che tengono la colonna lombare al fine di rafforzare l&#39;intera colonna vertebrale e di elevare il torace dalla panchina. NOTA: Con la disposizione descritta l&#39;animale deve essere in grado di respirare. Inoltre, nonostante i movimenti respiratori della gabbia toracica, la colonna vertebrale e il midollocavo deve anche rimanere immobile. </li><li> Rimuovere il processess spinoso da Thix a ThXII. Inserire delicatamente la lama inferiore della taglierina osso sotto la lamina di sinistra ThXII e chiudere la taglierina osso al fine di tagliare la lamina (figura 6). </li><li> Ripetere la stessa manovra per la lamina destra e successivamente rimuovere l&#39;arco posteriore. Ripetere i passaggi precedenti per la ThXI vertebre a Thix al fine di ottenere una laminectomia a quattro livelli. Rimuovere entrambi faccette articolari per ogni vertebra. NOTA: Nel corso della procedura, pulire il campo operatorio per emorragia locale. Per questo, utilizzare tamponi di cotone e di irrigazione con soluzione salina tiepida. Emostasi avviene sistematicamente in pochi minuti. </li></ol> 4. CEU Probe Posizionamento <ol><li> Coprire la dura madre con gel per ultrasuoni. Ciò permette la trasmissione effettiva degli ultrasuoni tra la sonda e il midollo spinale (Figura 7). </li><li> Stabilizzare l&#39;arguzia sonda ecograficamorsetto ha che può essere successivamente collegata al 3D-frame da un braccio articolato. Posizionare manualmente la sonda. Assicurarsi che la sonda è orientata ad ottenere un obliquo longitudinale fetta sagittale. In una posizione corretta, il midollo spinale è strettamente orizzontale sull&#39;immagine e il canale centrale del midollo spinale è visibile lungo l&#39;intero segmento del midollo spinale. NOTA: posizionamento deve essere guidata dal immagine B-mode in tempo reale visualizzato sullo schermo della macchina ad ultrasuoni. La distanza focale della sonda ecografica deve essere allineato con il canale centrale del midollo spinale. A questo punto, la faccia posteriore del midollo spinale è accessibile che alla fine permettere il posizionamento del dispositivo di simulazione. </li><li> Quando ottimale, bloccare il braccio snodato per stabilizzare la posizione. </li></ol> 5. Preparazione di contrasto Agent - microbolle Ricostituzione <ol><li> Utilizzando il contenuto di un kit commerciale ricostituzione e collegare lo stantuffo fissandolo tightly nella siringa (in senso orario). Aprire la confezione del sistema di trasferimento e rimuovere il tappo dell&#39;ago della siringa. Aprire il tappo del sistema di trasferimento e connettere la siringa al sistema di trasferimento (serrare ermeticamente). </li><li> Rimuovere il disco protettivo dal flaconcino. Inserire il flaconcino nel manicotto trasparente del </li><li> sistema di trasferimento e premere con decisione per bloccare il flaconcino nella sua sede. </li><li> Svuotare il contenuto della siringa nel flaconcino spingendo lo stantuffo. Agitare energicamente per 20 secondi per miscelare tutto il contenuto nel flacone di ottenere un latte liquido omogeneo bianco. </li><li> Capovolgere il sistema ed estrarre con attenzione l&#39;agente di contrasto nella siringa. Svitare la siringa dal sistema di trasferimento. Dopo ricostituzione (come indicato), 1 ml della dispersione prodotta contiene 8 microlitri di esafluoruro di zolfo nelle microbolle. Tracciare la sospensione di microbolle in una siringa 100 ml. Inserire la siringa 100 ml nella pompa elettrica. Chiudere il coperchio. </li><li> Avviare costante agitazione del remicrobolle costituite. Ottenuto agitazione costante per lenta rotazione della siringa, che mantiene la sospensione di microbolle. Collegare la pompa al catetere giugulare attraverso il tubo flessibile. Impostare la macchina ad ultrasuoni &quot;Modo Armonico&quot;. NOTA: Quest&#39;ultimo corrisponde al modo in cui le microbolle possono essere specificamente rilevati e visualizzati. Questa modalità ha un basso indice meccanico, che non distrugge le microbolle in contrapposizione alla B-mode. </li><li> Eliminare il catetere infondendo una prima dose (400 ml) di mezzo di contrasto. Durante questa prima infusione, controllare che le microbolle appaiono sullo schermo ultrasuoni. Questo conferma che l&#39;intero circuito (dalla siringa al sangue del ratto) è intatto e aperta. </li><li> Impostare la macchina ultrasuoni per &quot;B-mode&quot; per visualizzare il parenchima del midollo spinale e la distruzione dei pochi microbolle rimanenti nel flusso sanguigno. L&#39;alta frequenza del &quot;B-Mode&quot; tranalta energia smits alle microbolle, che permette loro di ripartizione. </li><li> Lasciate che l&#39;animale rimase immobile per circa 30 min. Questo periodo permette la stabilizzazione dei parametri emodinamici. </li></ol> 6. Valutazione SCBF nel midollo spinale Intact <ol><li> Impostare la macchina ad ultrasuoni per il &quot;Modo Armonico&quot;. Avviare simultaneamente (1) infusione di mezzo di contrasto (400 microlitri) e (2) il cronometro. NOTA: Durante l&#39;infusione, la concentrazione di microbolle nel sangue aumenta, consentendo l&#39;immaginazione contrasto del midollo spinale (Figura 8). Poiché le microbolle sono rapidamente distrutti, la concentrazione nel sangue di microbolle inizia a diminuire dopo l&#39;iniezione è terminata che genera una progressiva diminuzione visualizzazione contrasto del midollo spinale. </li><li> Dopo 1 minuto, selezionare (premere) il pulsante &quot;Store Clip&quot; sulla macchina ad ultrasuoni. Ciò consentirà uno per salvare 1 min di raw dati ultrasuoni e la registrazione del video immagini (che precedentemente era visualizzata sullo schermo ultrasuoni). </li><li> Impostare la macchina ad ultrasuoni di &quot;B-Mode&quot;. Ciò elimina i rimanenti microbolle. </li></ol> 7. SCI sperimentale <ol><li> Utilizzando il micromanipolatore collegata al 3D-frame, posizionare il dispositivo peso goccia impaction modo che la punta del dispositivo di simulazione viene a contatto con la dura madre (sulla linea mediana del midollo spinale), alla giunzione tra THX e ThXI (Figura 9) . NOTA: Questo livello dovrebbe corrispondere al centro del segmento del midollo spinale osservato con dispositivo ad ultrasuoni. L&#39;attaccante e il corpo del dispositivo d&#39;urto sono 8 mm di diametro. La punta del dispositivo di simulazione, che genererà la ferita, è di 3 mm di diametro. </li><li> Posizionare l&#39;attaccante del dispositivo compressione in una posizione 10 centimetri alto. Indurre il SIC sperimentale rilasciando l&#39;attaccante del dispositivo impatto. L&#39;attaccante cade e rilascia the di simulazione, ferendo il midollo spinale. L&#39;occlusione misura fornisce un effetto equivalente ad un peso di 10 g lasciata cadere da un&#39;altezza di 10 cm. </li></ol> 8. Valutazione della SCBF 5 min post-SCI <ol><li> Ripetere i passaggi descritti nella sezione 6 (Valutazione della SCBF). Le microbolle saranno in grado di passare attraverso il microcircolo danneggiata e l&#39;epicentro ferita rimarrà scuro (Figura 10). </li></ol> 9. sacrificio animale <ol><li> Euthanize l&#39;animale con iniezione letale intraperitoneale di pentobarbital (100 mg). </li></ol> 10. La quantificazione di SCBF da Analysis Offline <ol><li> Avviare il software Ultra-Extend impiegati per la quantificazione (in macchina ad ultrasuoni). Selezionare &quot;file&quot; e quindi selezionare i dati grezzi precedentemente salvati e aprire i file associati. Attivare la &quot;modalità di quantificazione&quot; premendo (selezione) il tasto &quot;Chi Q&quot;. Select &quot;Set ROI&quot; (pulsante) e scegliere la forma circolare. </li><li> Selezionare &quot;Draw ROI&quot; (pulsante) e disegnare sette regioni circolari adiacenti di interesse (ROI) sul midollo spinale (Figura 11). Aprire il menu &quot;Montaggio&quot; e scegliere la funzione &quot;Valore Curve&quot;. Osservare il software visualizzando diverse curve, ciascuna corrispondente alle variazioni di concentrazione microbolle all&#39;interno di una ROI. NOTA: Ogni curva ha un profilo &quot;perfusione-deperfusion&quot;. La prima fase della curva è piatta e corrisponde al periodo prima dell&#39;arrivo di microbolle. Nella seconda fase, la concentrazione di microbolle aumenta rapidamente a causa della infusione. Nella terza fase, che inizia quando l&#39;infusione è completo, la concentrazione di microbolle diminuisce progressivamente quando queste disintegratse nel sangue. </li><li> Posizionare la prima linea verticale all&#39;inizio della seconda fase del cUrve e selezionare &quot;SET&quot;. Questo informa il software da dove cominciare l&#39;analisi. </li><li> Posizionare la seconda linea verticale alla fine della registrazione e selezionare nuovamente &quot;SET&quot;. Questo informa il software dove fermarsi analisi. </li><li> Guarda il menu &quot;CV&quot; e registrare il valore &quot;AUC&quot;, che corrisponde al &quot;Area sotto la Curva&quot; analizzata. Questo valore è proporzionale alla SCBF all&#39;interno della corrispondente ROI. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial conflict of interest. The ultrasound machine was graciously lent by the Toshiba France company. The Vueject pump was graciously lent by the Bracco France company.

Anche se abbiamo descritto come utilizzare CEU in un ratto SCI modello di contusione, questo protocollo può essere modificato per adattarsi altri obiettivi sperimentali o modelli SCI. Abbiamo scelto di misurare SCBF a soli due punti di tempo (prima della ferita e 15 min post-SCI), tuttavia il numero di punti di tempo e il ritardo tra le misurazioni SCBF possono essere adattati per soddisfare le esigenze di altri studi. Ad esempio, nel nostro precedente lavoro 17, abbiamo misurato SCBF in cinque punti tempora...

Lesioni traumatiche del midollo spinale (SCI) è una condizione devastante che causa una forte compromissione motoria, sensoriale e funzioni autonome. Finora, nessuna terapia ha dimostrato la sua efficacia in pazienti. Per tale motivo, è importante individuare nuove tecniche in grado di migliorare la valutazione dei potenziali trattamenti e può chiarire ulteriormente lesioni pathiophysiology 1. SCI è diviso in due fasi sequenziali, denominato lesioni primari e secondari. La lesione primaria corrisponde l&#39;insulto meccanico iniziale. Considerando che i gruppi di lesioni secondarie una cascata di vari eventi biologici (come l&#39;infiammazione, lo stress ossidativo e l&#39;ipossia) che contribuiscono a seguito della progressiva espansione della lesione iniziale, danni ai tessuti e quindi neurologico deficit 2,3. Nella fase acuta della SCI, terapie neuroprotettive hanno lo scopo di ridurre la patologia danno secondario e should di conseguenza migliorare i risultati neurologici. Tra i tanti eventi di lesioni secondarie, ischemia svolge un ruolo cruciale di 4,5. A livello dell&#39;epicentro SCI, i microvasi parenchimali danneggiate ostacolano efficace midollo flusso ematico ombelicale (SCBF). Inoltre, SCBF è significativamente ridotta nella regione circostante l&#39;epicentro lesioni, un&#39;area particolare nota come &quot;zona penombra ischemica&quot;. Se SCBF non può essere rapidamente ripristinata entro queste regioni, l&#39;ischemia può portare alla necrosi parenchimale supplementare e danni ai tessuti ulteriormente nervoso. Come anche il mantenimento del tessuto minima può avere effetti sostanziali della funzione, è di grande interesse per sviluppare farmaci e terapie che possono ridurre l&#39;ischemia post-SCI. Per evidenziare questo fenomeno, lavoro precedente ha dimostrato che la conservazione di solo il 10% degli assoni mielinizzati è stato sufficiente per consentire a piedi nei gatti post-SCI 6. Sebbene diverse tecniche sono state descritte per valutare SCBF, lay tutti hanno limitazioni significative. Ad esempio, l&#39;uso di microsfere radioattive 7,8 e C14-iodopyrine autoradiografia 9 richiede una successiva sacrificio di animali e non può essere ripetuta in successivi punti temporali. La tecnica di depurazione idrogeno 10 dipende l&#39;inserimento di elettrodi intraspinali, che potrebbero danneggiare ulteriormente il midollo spinale. Mentre Doppler laser, fotopletismografia 14,15 e in vivo luce microscopia 16 hanno una molto limitata profondità / superficie di misura 11-13. La nostra squadra ha già dimostrato che un contrasto migliori ultrasuoni (CEU) di immagini può essere utilizzato per valutare in tempo reale e in vivo i cambiamenti SCBF nel parenchima midollo spinale di ratto 17. E &#39;importante notare che una tecnica simile è stata applicata da Huang et al. In un modello suino di SCI 18. CEU applica una specifica modalità di imaging ad ultrasuoni che permette di associare in scala di grigi im morfologicaetà (ottenuti per B-mode convenzionale) con distribuzione spaziale del flusso di sangue 19. Imaging SCBF e la quantificazione si basa su iniezione intravascolare di agenti di eco-contrasto. L&#39;agente di contrasto è costituito da microbolle di esafluoruro di zolfo (diametro di media circa 2,5 micron e il 90% ha un diametro inferiore a 6 micron) stabilizzata da fosfolipidi. Le microbolle riflettono il fascio di ultrasuoni emesso dalla sonda migliorando così ecogenicità sangue ed il contrasto dei tessuti secondo il loro flusso sanguigno. È quindi possibile valutare il flusso di sangue in una data regione di interesse secondo l&#39;intensità del segnale riflesso. Le microbolle sono anche sicuro e sono stati applicati clinicamente nell&#39;uomo. L&#39;esafluoruro di zolfo è rapidamente cancellata (media emivita terminale è di 12 min) e più del 80% del esafluoruro di zolfo somministrato viene recuperato nell&#39;aria espirata entro 2 minuti dopo l&#39;iniezione. Questo protocollo fornisce un modo semplice per utilizzare CEU iminvecchiamento per valutare i cambiamenti SCBF nel ratto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1154">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:397px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:229px;">Company</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:299px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:397px;">External Fixator Hoffman 3</td>
			<td style="width:229px;">Stryker, Kalamazoo, USA</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:397px;">Toshiba Applio</td>
			<td style="width:229px;">Toshiba, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Ultrasound machine</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:397px;">Sonovue</td>
			<td style="width:229px;">Bracco, Milan, Italy</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Contrast agent : microbubbles</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:397px;">Vueject pump</td>
			<td style="width:229px;">Bracco, Milan, Italy</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Electric pump for infusion of microbubbles bolus</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:397px;">Aquasonic Ultrasound Gel</td>
			<td style="width:229px;">Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:397px;">Isovet</td>
			<td style="width:229px;">Piramal Healthcare, Mumbai, India</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Isoflurane used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:397px;">Ultra Extend</td>
			<td style="width:229px;">Toshiba, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Software used for quantification of spinal cord blood flow</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:397px;">Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6</td>
			<td style="width:229px;">Canadian Tire, Toronto, Canada</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td>Set of pliers for Do-it-yourself job</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contrast enhanced ultrasound imaging for assessment of spinal cord blood flow in experimental spinal cord injury

Riduzione del midollo spinale del flusso sanguigno (SCBF) (cioè, ischemia) svolge un ruolo chiave nel traumatico lesioni del midollo spinale (SCI), fisiopatologia e di conseguenza è un obiettivo importante per le terapie neuroprotettive. Anche se diverse tecniche sono state descritte per valutare SCBF, tutti hanno limitazioni significative. Per superare questi ultimi, si propone l&#39;uso di immagini in tempo reale di contrasto ecografia (CEU). Qui si descrive l&#39;applicazione di questa tecnica in un modello di ratto contusione SCI. Un catetere giugulare viene prima impiantato per l&#39;iniezione ripetuta di mezzo di contrasto, una soluzione di cloruro di sodio di esafluoruro di zolfo microbolle incapsulate. La colonna vertebrale viene poi stabilizzato con un 3D-telaio su misura e il midollo spinale dura madre è esposta da una laminectomia a Thix-ThXII. La sonda ecografica viene quindi posizionato nel lato posteriore della dura madre (rivestito con gel ultrasuoni). Per valutare SCBF linea di base, una singola iniezione per via endovenosa (400 ml) di contraagente st viene applicato per registrare il suo passaggio attraverso l&#39;intatto microcircolo del midollo spinale. Un dispositivo di peso-drop viene successivamente utilizzato per generare un modello riproducibile contusione sperimentale di SCI. Agente di contrasto è ri-iniettato 15 min dopo l&#39;infortunio per valutare i cambiamenti post-SCI SCBF. CEU permette in tempo reale e in-vivo valutazione delle variazioni SCBF seguito SCI. Nel animale indenne, ecografia mostrava irregolare flusso di sangue lungo il midollo spinale intatto. Inoltre, 15 min post-SCI, c&#39;era ischemia critica al livello dell&#39;epicentro mentre SCBF rimasta conservata nelle zone più remote intatto. Nelle regioni adiacenti all&#39;epicentro (sia rostrale e caudale), SCBF è stato notevolmente ridotto. Ciò corrisponde a quella precedentemente descritta &quot;zona penombra ischemica&quot;. Questo strumento è di grande interesse per la valutazione degli effetti di terapie volte a limitare l&#39;ischemia e la necrosi dei tessuti risultante a seguito SCI.

Con il protocollo descritto sopra, è possibile mappare la SCBF lungo longitudinale midollo spinale segmento sagittale. Nel midollo spinale intatto, sembra esserci irregolarità SCBF all&#39;interno del parenchima (Figura 12). Questo può essere spiegato con la ripartizione variabile delle arterie radiculo midollare (RMA) da un animale all&#39;altro. RMA si riferisce a segmentale arterie che raggiungono l&#39;arteria spinale anteriore (ASA) e quindi fornire apporto di sangue...

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Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury

Contrast Enhanced Ultrasound imaging is a reliable in-vivo tool for quantifying spinal cord blood flow in an experimental rat spinal cord injury model. This paper contains a comprehensive protocol for application of this technique in association with a contusion model of thoracic spinal cord injury.

Ultrasuoni Imaging per la valutazione di Spinal Cord Blood Flow in Sperimentale midollo spinale Lesioni

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an ...

contrast-enhanced-ultrasound-imaging-for-assessment-spinal-cord-blood

Research

JoVE Journal

Medicine

13.9K Views.  Faculté de Médecine Paris Diderot Paris VII, U942. Contrast Enhanced Ultrasound imaging is a reliable in-vivo tool for quantifying spinal cord blood flow in an experimental rat spinal cord injury model. This paper contains a comprehensive protocol for application of this technique in association with a contusion model of thoracic spinal cord injury.

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Acute and Chronic Tactile Sensory Testing after Spinal Cord Injury in Rats

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory testing in rat SCI models is needed. However, until recently, no single testing approach had been validated for SCI so that standardized methods have not been implemented across labs. Additionally, available testing methods could not be implemented acutely or when severe motor impairments existed, preventing studies of the development of SCI-induced allodynia3. Here we present two validated sensory testing methods using von Frey Hair (VFH) monofilaments which quantify changes in tactile sensory thresholds after SCI4-5. One test is the well-established Up-Down test which demonstrates high sensitivity and specificity across different SCI severities when tested chronically5. The other test is a newly-developed dorsal VFH test that can be applied acutely after SCI when allodynia develops, prior to motor recovery4-5. Each VFH monofilament applies a calibrated force when touched to the skin of the hind paw until it bends. In the up-down method, alternating VFHs of higher or lower forces are used on the plantar L5 dermatome to delineate flexor withdrawal thresholds. Successively higher forces are applied until withdrawal occurs then lower force VFHs are used until withdrawal ceases. The tactile threshold reflects the force required to elicit withdrawal in 50% of the stimuli. For the new test, each VFH is applied to the dorsal L5 dermatome of the paw while the rat is supported by the examiner. The VFH stimulation occurs in ascending order of force until at least 2 of 3 applications at a given force produces paw withdrawal. Tactile sensory threshold is the lowest force to elicit withdrawal 66% of the time. Acclimation, testing and scoring procedures are described. Aberrant trials that require a retest and typical trials are defined. Animal use was approved by Ohio State University Animal Care and Use Committee.

We describe two tactile sensory testing methods for acute or chronic periods of spinal cord injury in rats. These validated procedures can detect the development and maintenance of allodynia-like sensations.

Acuta e Cronica test sensoriale tattile dopo lesione del midollo spinale in ratti

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory ...

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A Contusion Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is described to obtain a consistent model of severe SCI. Use of a stereotactic frame and computer controlled impactor allows for creation of reproducible injury. Hypothermia and urinary tract infection pose significant challenges in the post-operative period. Careful monitoring of animals with daily weight recording and bladder expression allows for early detection of post-operative complications. The functional results of this contusion model are equivalent to transection models. The contusion model can be utilized to evaluate the efficacy of both neuroprotective and neuroregenerative approaches.

A contusion model of severe spinal cord injury is described. Detailed pre-operative, operative and post-operative steps are described to obtain a consistent model.

Un modello Contusione di gravi lesioni del midollo spinale nei ratti

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is ...

Evaluation of Respiratory Muscle Activation Using Respiratory Motor Control Assessment (RMCA) in Individuals with Chronic Spinal Cord Injury

During breathing, activation of respiratory muscles is coordinated by integrated input from the brain, brainstem, and spinal cord. When this coordination is disrupted by spinal cord injury (SCI), control of respiratory muscles innervated below the injury level is compromised1,2 leading to respiratory muscle dysfunction and pulmonary complications. These conditions are among the leading causes of death in patients with SCI3. Standard pulmonary function tests that assess respiratory motor function include spirometrical and maximum airway pressure outcomes: Forced Vital Capacity (FVC), Forced Expiratory Volume in one second (FEV1), Maximal Inspiratory Pressure (PImax) and Maximal Expiratory Pressure (PEmax)4,5. These values provide indirect measurements of respiratory muscle performance6. In clinical practice and research, a surface electromyography (sEMG) recorded from respiratory muscles can be used to assess respiratory motor function and help to diagnose neuromuscular pathology. However, variability in the sEMG amplitude inhibits efforts to develop objective and direct measures of respiratory motor function6. Based on a multi-muscle sEMG approach to characterize motor control of limb muscles7, known as the voluntary response index (VRI)8, we developed an analytical tool to characterize respiratory motor control directly from sEMG data recorded from multiple respiratory muscles during the voluntary respiratory tasks. We have termed this the Respiratory Motor Control Assessment (RMCA)9. This vector analysis method quantifies the amount and distribution of activity across muscles and presents it in the form of an index that relates the degree to which sEMG output within a test-subject resembles that from a group of healthy (non-injured) controls. The resulting index value has been shown to have high face validity, sensitivity and specificity9-11. We showed previously9 that the RMCA outcomes significantly correlate with levels of SCI and pulmonary function measures. We are presenting here the method to quantitatively compare post-spinal cord injury respiratory multi-muscle activation patterns to those of healthy individuals.

Evaluation of Respiratory Muscle Activation Using Respiratory Motor Control Assessment RMCA in Individuals with Chronic Spinal Cord Injury

The purpose of this publication is to present our original work on a multi-muscle surface electromyographic approach to quantitatively characterize respiratory muscle activation patterns in individuals with chronic spinal cord injury using vector-based analysis.

Valutazione delle vie respiratorie di attivazione muscolare Utilizzando respiratoria Motor Control Assessment (RMCA) in soggetti con lesioni spinali croniche

During breathing, activation of respiratory muscles is coordinated by integrated input from the brain, brainstem, and spinal cord. When this coordination ...

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as multiple sclerosis. Here we present a low-cost and reproducible glass window implantation protocol that is suitable for intravital microscopy and studying the dynamics of spinal cord cytoarchitecture with subcellular resolution in live adult mice with EAE. Briefly, we surgically expose the vertebrae T12-L2 and construct a chamber around the exposed vertebrae using a combination of cyanoacrylate and dental cement. A laminectomy is performed from T13 to L1, and a thin layer of transparent silicone elastomer is applied to the dorsal surface of the exposed spinal cord. A modified glass cover slip is implanted over the exposed spinal cord taking care that the glass does not directly contact the spinal cord. To reduce the infiltration of inflammatory cells between the window and spinal cord, anti-inflammatory treatment is administered every 2 days (as recommended by ethics committee) for the first 10 days after implantation. EAE is induced only 2-3 weeks after the cessation of anti-inflammatory treatment.
Using this approach we successfully induced EAE in 87% of animals with implanted windows and, using Thy1-CFP-23 mice (blue axons in dorsal spinal cord), quantified axonal loss throughout EAE progression. Taken together, this protocol may be useful for studying the recruitment of various cell populations as well as their interaction dynamics, with subcellular resolution and for extended periods of time. This intravital imaging modality represents a valuable tool for developing therapeutic strategies to treat autoimmune demyelinating diseases such as EAE.

We describe a method for implanting and maintaining glass windows over the exposed spinal cords of adult mice for studying experimental autoimmune encephalomyelitis. These windows provide chronic optical access to the spinal cord for monitoring cell dynamics at the subcellular level in live animals using two-photon microscopy.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI). Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, social, and economical effects are staggering. Therefore, further research into the effects of TBI and effective treatments is necessary. The controlled cortical impact (CCI) model induces traumatic brain injuries ranging from mild to severe. This method uses a rigid impactor to deliver mechanical energy to an intact dura exposed following a craniectomy. Impact is made under precise parameters at a set velocity to achieve a pre-determined deformation depth. Although other TBI models, such as weight drop and fluid percussion, exist, CCI is more accurate, easier to control, and most importantly, produces traumatic brain injuries similar to those seen in humans. However, no TBI model is currently able to reproduce pathological changes identical to those seen in human patients. The CCI model allows investigation into the short-term and long-term effects of TBI, such as neuronal death, memory deficits, and cerebral edema, as well as potential therapeutic treatments for TBI.

Traumatic brain injuries (TBIs) remain a serious health problem. Using the controlled cortical impact surgery model, research on the effects of TBI and possible treatment methods may be performed.

Controllata corticale modello Impact per trauma cranico

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter connected to a radio transmitter into the femoral artery of rats that underwent a T4 spinal cord transection with or without grafting of embryonic brainstem-derived neural stem cells expressing green fluorescent protein. Compared to other methods such as cannula insertion or tail-cuff, telemetry is advantageous to continuously monitor blood pressure and heart rate in freely moving animals. It is also capable of long term multiple data acquisitions. In spinal cord injured rats, basal cardiovascular data under unrestrained condition and autonomic dysreflexia in response to colorectal distension were successfully recorded. In addition, cardiovascular parameters before and after SCI can be compared in the same rat if a transmitter is implanted before a spinal cord transection. One limitation of the described telemetry procedure is that implantation in the femoral artery may influence the blood supply to the ipsilateral hindlimb.

We present a protocol for using a radio-telemetric system to record cardiovascular parameters in T4 spinal cord transected rats eight weeks after embryonic brainstem neural stem cell grafting into the lesion site. Telemetry is an advanced technique to accurately evaluate cardiovascular function in conscious freely moving spinal cord injured rats.

Un sistema radio-telemetria per monitorare la funzionalità cardiovascolare in ratti con midollo spinale e Transection embrionali staminali neurali Innesti cellulari

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

Synergetic Use of Neural Precursor Cells and Self-assembling Peptides in Experimental Cervical Spinal Cord Injury

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. Clinically, more than 50% of SCI affect the cervical spine1. As a consequence of the primary injury, a cascade of secondary mechanisms including inflammation, apoptosis, and demyelination occur finally leading to tissue scarring and development of intramedullary cavities2,3. Both represent physical and chemical barriers to cell transplantation, integration, and regeneration. Therefore, shaping the inhibitory environment and bridging cavities to create a supportive milieu for cell transplantation and regeneration is a promising therapeutic target4. Here, a contusion/compression model of cervical SCI using an aneurysm clip is described. This model is more clinically relevant than other experimental models, since complete transection or ruptures of the cord are rare. Also in comparison to the weight drop model, which in particular damage the dorsum columns, circumferential compression of the spinal cord appears advantageous. Clip closing force and duration can be adjusted to achieve different injury severity. A ring spring facilitates precise calibration and constancy of clip force. Under physiological conditions, synthetic self-assembling peptides (SAP) self-assemble into nanofibers and thus, are appealing for application in SCI5. They can be injected directly into the lesion minimizing damage to the cord. SAPs are biocompatible structures erecting scaffolds to bridge intramedullary cavities and thus, equip the damaged cord for regenerative treatments. K2(QL)6K2 (QL6) is a novel SAP introduced by Dong et al.6 In comparison to other peptides, QL6 self-assembles into &#946;-sheets at neutral pH6.14 days after SCI, after the acute stage, SAPs are injected into the center of the lesion and neural precursor cells (NPC) are injected into adjacent dorsal columns. In order to support cell survival, transplantation is combined with continuous subdural administration of growth factors by osmotic micro pumps for 7 days.

Treating cervical spinal cord injury with both self-assembling peptides (SAP) and neural precursor cells (NPC), together with growth factors, is a promising approach to promote regeneration and recovery. A contusion/compression aneurysm clip rat model of cervical SCI and combined treatment involving SAP injection and NPC transplantation is established.

Utilizzo sinergico delle cellule neurali e precursori peptidi autoassemblanti in Sperimentale Cervical Spinal Cord Injury

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. ...

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can be used both to investigate the biological responses to injury and to test potential therapies. Contusion or compression injury delivered to the surgically exposed spinal cord are the most widely used models of the pathology. In this report the experimental contusion is performed by using the Infinite Horizon (IH) Impactor device, which allows the creation of a reproducible injury animal model through definition of specific injury parameters. Stem cell transplantation is commonly considered a potentially useful strategy for curing this debilitating condition. Numerous studies have evaluated the effects of transplanting a variety of stem cells. Here we demonstrate an adapted method for spinal cord injury followed by tail vein injection of cells in CD1 mice. In short, we provide procedures for: i) cell labeling with a vital tracer, ii) pre-operative care of mice, iii) execution of a contusive spinal cord injury, and iv) intravenous administration of post mortem neural precursors. This contusion model can be utilized to evaluate the efficacy and safety of stem cell transplantation in a regenerative medicine approach.

Spinal cord injury is a traumatic condition that causes severe morbidity and high mortality. In this work we describe in detail a contusion model of spinal cord injury in mice followed by a transplantation of neural stem cells.

Neural Stem Cell Transplantation in Sperimentale Contusivi Model of Spinal Cord Injury

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

Calibrated Forceps Model of Spinal Cord Compression Injury

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The calibrated forceps model of compression injury is a convenient, low cost, and very reproducible animal model for SCI. We used a pair of modified forceps in accordance with the method published by Plemel et al. (2008) to laterally compress the spinal cord to a distance of 0.35 mm. In this video, we will demonstrate a dorsal laminectomy to expose the spinal cord, followed by compression of the spinal cord with the modified forceps. In the video, we will also address issues related to the care of paraplegic laboratory animals. This injury model produces mice that exhibit impairment in sensation, as well as impaired hindlimb locomotor function. Furthermore, this method of injury produces consistent aberrations in the pathology of the SCI, as determined by immunohistochemical methods. After watching this video, viewers should be able to determine the necessary supplies and methods for producing SCI of various severities in the mouse for studies on SCI and/or treatments designed to mitigate impairment after injury.

Spinal cord injury models should be highly reproducible. We demonstrate that the calibrated forceps compression model of spinal cord injury is an easy to use surgical method for generating reproducible injuries to the murine spinal cord.

Calibrato forcipe Modello di Spinal Cord Injury Compression

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

Un neonatale mouse Spinal Cord Injury compressione Modello

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Methods Article

Ultrasuoni Imaging per la valutazione di Spinal Cord Blood Flow in Sperimentale midollo spinale Lesioni