Il nostro protocollo studia la diversità di lieviti e muffe nel suolo utilizzando campioni di terreno ottenuti da diverse regioni climatiche. Ciò fornisce approfondimenti sulla diversità ambientale del lievito e aiuta a tracciare le specie patogene. Il protocollo offre un metodo economico e veloce per la raccolta di lieviti e muffe dal terreno.
I campioni di terreno possono essere completamente elaborati per ottenere isolati in appena sette giorni. Una configurazione sperimentale ben organizzata, come l'etichettatura dei tubi di coltura e la preparazione dei supporti con un giorno di anticipo, è la chiave per evitare di sentirsi sopraffatti durante l'esperimento. Inizia con la preparazione di un set di tubi di coltura sterili da 13 millilitri.
Etichettandoli con ID campione di terreno, quindi utilizzare una pipetta sierologica per aggiungere cinque millilitri di estratto di lievito-peptone-destrosio brodo integrato con cloramfenicolo e benomil in ogni tubo. All'interno di un armadio di biosicurezza per organismi di livello due, trasferire circa 0,1 grammi di terreno nel tubo di coltura appropriato utilizzando un applicatore sterile di punta piana in legno. Tappare saldamente il tubo fino alla prima fermata, evitando fuoriuscite e consentendo lo scambio d'aria durante l'incubazione.
Quindi incubare i tubi di coltura in un tamburo a rulli per 24 ore a una temperatura ritenuta ottimale per massimizzare la crescita del lievito. Quindi etichettare le piastre di agar peptone-destrosio dell'estratto di cloruro e benomyl con l'ID del campione di terreno prima di trasferire il surnatante sul terreno sul terreno solido. Rimuovere i tubi di coltura dal tamburo a rulli.
Quindi, all'interno di un armadio di biosicurezza per organismi di livello due, ruotare brevemente il tubo per attirare particelle di terreno e cellule che potrebbero essersi depositate nella parte inferiore in sospensione. Quindi, trasferire 100 microlitri del surnatante su una piastra utilizzando una micropipetta. Utilizzare uno spandicelle sterile riutilizzabile per distribuire il liquido in modo completo e uniforme sulla superficie dell'agar.
Dopo aver concesso un tempo di incubazione sufficiente di due o tre giorni, ispezionare le piastre per qualsiasi crescita di lievito all'interno di un armadio di biosicurezza per organismi di livello due. Cerca lieviti cremosi, rotondi, opachi che possano essere facilmente distinti dalle colonie batteriche e di muffa. Selezionare una colonia simile a un lievito da ogni piatto utilizzando bastoncini di applicatore sterili in legno con punta semplice.
Trasferire ogni colonia selezionata su un estratto di lievito fresco peptone-destro agar piastre integrate con cloramfenicolo e benomil e striscia per singole colonie. Eseguire tre strisce separate e utilizzare un nuovo stick applicatore per ogni striscia. Successivamente, utilizzare cellule fresche sviluppate su una piastra per eseguire una reazione a catena della polimerasi della colonia.
Utilizzare distanziali trascritti interni ITS1 e ITS4 primer per amplificare il gene della codifica a barre fungina. Confronta la sequenza di distanziatori trascritti internamente ottenuta dei ceppi di lievito, due sequenze depositate in database pubblici, come il National Center for Biotechnology Information GenBank e UNITE per stabilire l'identità delle specie. Aggiungere terreno a tubi di microcentrifuga da 1,5 millilitri contenenti un millilitro di brodo di destrosio Sabouraud e incubare a 50 gradi Celsius per due o quattro giorni.
Per trasferire i miceli dal brodo inoculato del terreno su piastre di agar estratto di malto, in primo luogo, identificare gli inoculi del suolo che hanno una crescita miceliale visibile aggiungere il brodo di destrosio Sabouraud al confine dell'aria. Quindi utilizzare bastoncini di applicatore a punta semplice in legno sterilizzati per trasferire il micelio al centro di una piastra di agar estratto di malto e incubare questi piatti di agar estratto di malto impostati a 37 gradi Celsius per tre giorni. Per la selezione dei miceli, con proprietà morfologiche di Aspergillus fumigatus, identificare le colonie di muffe che hanno una caratteristica crescita verde ondeggiante.
All'interno di un armadio di biosicurezza per organismi di livello due, raccogliere conidi o miceli raschiando la superficie una volta usando bastoncini di applicazione della punta piana in legno sterilizzati o un anello di inoculazione e trasferirlo al centro di una piastra di agar estratto di malto strisciando sull'agar per singole colonie. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per due giorni. Utilizzando un bastoncino di applicazione sterile o un ciclo di inoculazione, sottocultura una singola colonia generata sull'estratto di malto di agar strisciando la colonia una volta.
Distribuire le spore raccolte al centro del piatto. Preparare una soluzione sterile di glicerolo al 30% per raccogliere le spore o i miceli di Aspergillus fumigatus per la conservazione in coltura. Dopo i due giorni di incubazione delle piastre di agar a 37 gradi Celsius, aspirare un millilitro della soluzione di glicerolo al 30% usando una pipetta e disperderlo nella colonia di Aspergillus fumigatus.
Per l'identificazione fenotipica dei ceppi di Aspergillus fumigatus, aspirare 10 microlitri degli stock miceliali e sporici da aggiungere in 990 microlitri di acqua. Vortex questa sospensione di spore diluite ed erogare 10 microlitri della sospensione su un vetrino per microscopio standard. Quindi utilizzando un microscopio composto con ingrandimento 400X visualizzare la sospensione e individuare i conidiofori.
Confronta la morfologia conidiofora osservata con la morfologia dell'Aspergillus fumigatus conidiophore. Per determinare la dimensione corretta del frammento per ciascuno dei nove loci micro-satellite, utilizzare un software in grado di analizzare i frammenti. Recupera i dati grezzi ottenuti dall'elettroforesi capillare e assegna un punteggio alle dimensioni dei frammenti in base al picco più grande utilizzando il software di analisi frammentato.
Quindi, convertire le dimensioni dei frammenti in numeri ripetuti per ciascuno dei nove bassi utilizzare le dimensioni dei frammenti dei numeri di ripetizione del ceppo di riferimento Af293. Da 3.826 campioni di suolo raccolti da 53 località in nove paesi, 1.473 ceppi di lievito sono stati isolati. La migliore temperatura di incubazione per ogni paese è stata determinata in base alla sua temperatura media annuale.
Nell'analisi di rarefazione per ogni paese, l'indice di diversità di Shannon è stato utilizzato come misura della diversità del lievito del suolo. Le curve di rarefazione risultanti si avvicinavano all'asintoto di saturazione, indicando che un campionamento aggiuntivo non avrebbe probabilmente prodotto una maggiore diversità di lieviti. La crescita miceliale su placche formava la morfologia verde ondeggiata tipica dell'Aspergillus fumigatus.
Altre specie fungine termotolleranti potrebbero essere presenti all'interno dello stesso campione di terreno e far crescere l'Aspergillus fumigatus sulla stessa piastra o da sole. La struttura del conidioforo aspergillus fumigatus osservata e identificata al microscopio ottico ha rivelato che i conidiofori hanno una palla sulla morfologia del bastone e i conidiofori sono uniseriati, dove le fialidi attaccate alle catene dei conidi sono attaccate direttamente alla vescicola sferica. Un bieriato generato dal cromatogramma ha rivelato i tre canali visualizzando le lunghezze dei frammenti di Aspergillus fumigatus dinucleotide, trinucleotide e tetranucleotide brevi ripetizioni tandem loci.
È possibile generare una rete di spanning minimo di alta qualità utilizzando lo script R plot_poppr_msn o imsn. Un'analisi discriminatoria dei componenti principali è un altro metodo per visualizzare le relazioni genetiche tra i ceppi. L'aggiunta di benomil e cloramfenicolo ai mezzi di crescita previene la crescita di muffe e batteri, rispettivamente, e favorisce la selezione del lievito.
Il cloramfenicolo riduce anche la fermentazione nei mezzi, riducendo l'accumulo di gas nei tubi di incubazione. L'esecuzione di metagenomica su campioni di suolo fornirà ulteriori informazioni sulla diversità culturale. Test sensibili di ceppi di A.fumigatus identificheranno la presenza di genotipi di resistenza.
Questo protocollo può essere applicato ad altri sistemi di lieviti e muffe con poche modifiche. Ha facilitato lo studio della diversità culturale del lievito del suolo e dei suoi predittori su scala globale.
