L'isolamento dei funghi entomopatogeni è significativo per lo sviluppo di un biopesticida e può essere utile per studiare la diversità, la distribuzione e l'ecologia di questo particolare gruppo. L'uso di esche per insetti per isolare i funghi entomopatogeni è considerato un metodo a basso costo e altamente efficiente. cloramfenicolo, tiabendazolo, cicloeximide, mezzi artificiali non usano dodina e richiedono meno spazio nel processo di campionamento del suolo.
I passaggi critici includono lo studio delle placche CTC dopo una e due settimane per impedire ad altri funghi di restringersi e funghi entomopatogeni in fase di sviluppo, e quindi identificare colonie di funghi entomopatogeni in base alla loro macro morfologia e micro morfologia. Inizia raccogliendo 800 grammi di terreno ad una profondità di 10 centimetri usando una piccola pala. Conservare i campioni in sacchetti di polipropilene a temperatura ambiente fino all'inizio dell'esperimento.
Piccole radici possono anche essere raccolte poiché i funghi entomopatogeni sono noti per avere competenza rizosfera. Per l'isolamento di funghi con cloramfenicolo, tiabendazolo, cicloeximide o mezzo artificiale selettivo CTC, pesare 0,35 grammi del campione di terreno con o senza radici. Posizionare questo campione in un microtubo da 1,5 millilitri.
Mentre si lavora in un armadio di biosicurezza, aggiungere un millilitro di sospensione acquosa sterile allo 0,01% di volume percentuale di poliossietilene sorbitano monooleato al microtubo contenente terreno e ruotare il tubo per 30 secondi. Al termine rimuovere e pipettare 50 microlitri del surnatante sul centro delle piastre di Petri con mezzo CTC. Quindi utilizzare una spatola Drigalski sterile di un diametro di sei millimetri per disperdere in modo omogeneo le sospensioni sulla superficie del mezzo.
Incubare le piastre in camere climatiche a 25 gradi Celsius e un minimo dell'80% di umidità relativa al buio. Dopo sette, 14 e 21 giorni di incubazione, osservare le piastre per la crescita delle colonie fungine. Isolare i funghi utilizzando larve di superficie disinfettate Galleria mellonella e Tenebrio molitor in fase avanzata come esche per insetti.
Immergere la larva nello 0,5% di ipoclorito di sodio per un minuto per la sterilizzazione. Quindi lavare le larve due volte con acqua sterile. Assemblare le esche in vasi di plastica con 10 piccoli fori di 10 millimetri di diametro nel coperchio contenente 250 grammi del terreno raccolto.
Omogeneizzare il terreno a giorni alterni per consentire il massimo contatto delle larve con il terreno e analizzare quotidianamente i vasi, alla ricerca di insetti morti. Dopo aver rimosso gli insetti morti dalla pentola, sterilizzare superficialmente gli insetti con ipoclorito di sodio allo 0,5% per un minuto. Per favorire la micosi, posizionare gli insetti sterili in una camera umida all'80% di umidità relativa e 25 gradi Celsius per sette giorni.
Sulla micosi, raccogliere i conidi dalla superficie dell'insetto e con l'aiuto del ciclo microbiologico, posizionare i conidi su terreno di agar destrosio di patate contenente lo 0,05% di cloramfenicolo o mezzo PDAC al microscopio stereoscopico. In alternativa, posizionare tutte le larve infette sul mezzo PDAC. E incubare le piastre di coltura in una camera climatica come spiegato in precedenza.
Dopo 14 giorni di incubazione, identificare le specie EPF analizzando le macro caratteristiche morfologiche delle colture fungine sulle piastre come descritto nel manoscritto. Quindi trasferire i conidi aerei alle colture di scorrimento per tre giorni all'80% di umidità relativa e 25 gradi Celsius. Dopo tre giorni macchiare il vetrino con blu lattofenolo per osservarne le caratteristiche microscopiche.
Al microscopio ottico, osservare le strutture fungine come disposizione, conidiofori, forma e dimensioni dei conidi a 400 volte e confermare l'identificazione EPF. Nello studio, 51 ceppi EPF di specie Metarhizium e Beaveria sono stati isolati da 524 campioni di suolo. L'analisi rappresentativa mostra le caratteristiche micromorfologiche di alcuni isolati di specie metarhizium e specie beaveria.
La presenza di EPF nei 24 campioni di suolo è stata studiata utilizzando tre diversi metodi di isolamento. L'esca Galleria mellonella si è dimostrata più efficiente nell'isolamento, seguita dall'esca molitor Tenebrio e dal mezzo CTC. Gli stessi 24 campioni di terreno non hanno mostrato alcun recupero di specie di Beaveria, ma solo Metarhizium.
Le cose più importanti da ricordare sono il trasferimento dei conidi aerei al rivestimento del vetrino osservando le caratteristiche del microscopio e confermando l'identificazione dei funghi entomopatogeni utilizzando chiavi morfologiche. Ulteriori metodi includono l'uso di altri mezzi artificiali selettivi con sostanze chimiche specifiche per ridurre la crescita di contaminanti come la dodina. La ricerca di nuovi isolati fungini con eccezionali caratteristiche di biocontrollo è fondamentale per aumentare l'efficacia dei funghi nel controllo degli artropodi-parassiti ed esplorare ulteriori domande nel campo della patologia degli invertebrati.
