Questo protocollo evidenzia i passaggi chiave per amplificare, differenziare e crioconservare le cellule epiteliali nasali primarie. Nelle nostre condizioni di coltura, le cellule epiteliali nasali primarie imitano l'epitelio polmonare. Ciò consente colture derivate dal paziente e studi di medicina personalizzata da cellule fresche o biobancariche.
Le colture epiteliali nasali derivate dal paziente possono essere utilizzate per valutare l'attività della CFTR e aiutare con la terapia della fibrosi cistica valutando la risposta individuale del paziente alle nuove terapie. A dimostrare la procedura sarà Aurelie Hatton, un ingegnere del mio laboratorio. Per iniziare, far crescere cellule epiteliali nasali o HNE, in 10 millilitri di mezzo di amplificazione.
Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica in un pallone rivestito di collagene di 75 centimetri quadrati fino a raggiungere l'80-90% di confluenza. Cambia il mezzo ogni 48-72 ore. Successivamente, lavare le cellule con 10 millilitri di DPBS senza magnesio e calcio.
Aspirare e scartare la soluzione salina. Prima di aggiungere due millilitri di 0,25% di tripsina e restituire il pallone all'incubatrice per otto-12 minuti. Successivamente, picchiettare saldamente il pallone con un palmo per aiutare il distacco delle cellule.
Aggiungere 10 millilitri del mezzo di amplificazione per fermare la reazione enzimatica. Risciacquare vigorosamente il matraccio usando una pipetta da 10 millilitri per aspirare ed espellere il mezzo di amplificazione sulla superficie del pallone per risciacquare e staccare le cellule e raccogliere le cellule in un tubo da 15 millilitri. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius ed eliminare il surnatante.
Sospendere nuovamente il pellet in cinque-10 millilitri di mezzo di amplificazione. Quindi contare le cellule su un emocitometro. Dopo il conteggio delle cellule, centrifugare le cellule a 500 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e scartare il surnatante.
Quindi sospendere nuovamente il pellet nel mezzo di congelamento arricchito per ottenere da tre a cinque volte 10 alle sei cellule per millilitro e metterlo in una fiala criometrica. Congelare lentamente le cellule riducendo la temperatura di circa un grado Celsius al minuto in un contenitore di criocongelamento appropriato a meno 80 gradi Celsius. Il giorno successivo, spostare il campione conservato in un contenitore di stoccaggio dell'azoto per la conservazione a lungo termine.
Riscaldare il mezzo di amplificazione appena preparato a bagnomaria impostato a 37 gradi Celsius. Rimuovere le fiale criologiche dal serbatoio di stoccaggio dell'azoto e posizionarle rapidamente a bagnomaria, facendo attenzione a non immergere l'intera fiala in acqua. Rimuovere le fiale criologiche dal bagno d'acqua quando rimane solo una piccola goccia congelata.
Pulire le fiale con alcool al 70% e posizionarle sotto il cofano. Utilizzando una pipetta da un millilitro, trasferire le celle scongelate in un tubo da 15 millilitri. Quindi aggiungere un millilitro di mezzo di amplificazione caldo in modo a goccia.
Dopo un minuto, aggiungere un altro millilitro di mezzo di amplificazione e attendere un minuto. Aggiungere 10 millilitri di mezzo di amplificazione e centrifugare a 500 volte G per due minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare e scartare il surnatante.
Sospendere nuovamente il pellet in un volume di mezzo di amplificazione necessario per ottenere una densità di cella di una volta 10 alle sei celle per millilitro. Dopo aver seminato le cellule su un pallone rivestito di collagene di 25 centimetri quadrati, contenente mezzo di amplificazione, incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Osservare visivamente l'espansione cellulare per due o tre giorni prima di eseguire l'amplificazione cellulare, come dimostrato in precedenza.
Semina le cellule ad una densità di 3,3 volte 10 alla quinta cellula per filtro su filtri porosi rivestiti di collagene di 0,33 centimetri quadrati, integrati con 300 microlitri di mezzo di amplificazione sul lato apicale e 900 microlitri di mezzo liquido d'aria sul lato basolaterale. Dopo tre giorni, aspirare il mezzo apicale e coltivare le cellule all'interfaccia aria-liquido per tre o quattro settimane nel mezzo aria-liquido per stabilire un epitelio differenziato. Cambiare il mezzo basale ogni 48-72 ore.
Le cellule HNE fresche coltivate all'interfaccia aria-liquido mostravano una caratteristica tipica dell'epitelio respiratorio polarizzato e differenziato. Nei 78 campioni di cellule HNE, i tassi di successo sono stati confrontati nella spazzolatura nasale seminata immediatamente e dopo uno o sette giorni di trasporto in un mezzo di lavaggio. La percentuale media iniziale di colture di successo era dell'82% e ha raggiunto l'87% nei campioni seminati tra zero e cinque giorni.
L'83% dei campioni che si sono differenziati con successo in condizioni fresche hanno avuto successo anche in campioni crioconservati. Allo stesso modo, nei campioni che non sono riusciti a differenziarsi in condizioni fresche, il 71% non ha avuto successo anche in condizioni di congelamento-scongelamento. Inoltre, il 50% dei campioni congelati tra due o tre volte 10 alle sei cellule per fiala criogenica non è riuscito a crescere quando scongelato, raggiungendo l'80% per meno di due volte 10 alle sei cellule.
Per la variazione della corrente di cortocircuito in risposta alla forskolina e la variazione della corrente di cortocircuito in risposta all'inibitore CFTR 172 nelle cellule HNE trattate con DMSO, non è stata osservata alcuna differenza significativa tra HNE scongelato fresco o congelato. Al momento del trattamento, entrambi i tipi di cellule hanno mostrato una correzione significativa con un aumento della variazione della corrente di cortocircuito in risposta alla forskolina e una diminuzione della variazione della corrente di cortocircuito in risposta all'inibitore CFTR 172. la risposta correttiva delle doppie terapie con funzione CFTR è stata valutata rispetto alla variazione di corrente di cortocircuito delle cellule HNE trattate con DMSO in risposta a forskolina e in risposta all'inibitore CFTR 172 sono state significativamente migliorate sia da VX-809 più VX-770 che da VX-661 più VX-770.
Sono state confrontate tre diverse terapie modulatrici CFTR in HNE da sei pazienti omozigoti F508del. Se usato in combinazione con un correttore CFTR e un potenziatore, sia un vertice che un modulatore CFTR, ha corretto la variazione della corrente di cortocircuito in risposta alla forskolina e la variazione della corrente di cortocircuito in risposta all'inibitore CFTR 172 in misura simile. Quando si congelano le cellule HNE, è importante avere almeno 3 milioni di cellule per fiala crio per aumentare le possibilità di un buon risultato dopo lo scongelamento.
L'attività cftr nelle cellule HNE ha dimostrato di essere un buon modello predittivo per valutare e regolare le terapie personalizzate nella fibrosi cistica.
