Questo metodo può essere utilizzato per valutare in vitro la tossicità di nuove formulazioni di prodotti oftalmici. Affinando le concentrazioni di sostanze chimiche e formulazioni di prodotti utilizzando cellule oculari in vitro, l'uso di animali per valutare la sicurezza di nuovi prodotti può essere ridotto al minimo. I saggi in vitro valutano gli endpoint di tossicità che non possono essere valutati in vivo, come la determinazione dell'effetto di una sostanza chimica sulla funzione mitocondriale, sull'integrità della membrana cellulare e sull'attività enzimatica.
Valutare la tossicità cellulare in vitro è la chiave per comprendere i potenziali meccanismi di tossicità. Questo è essenziale per stabilire una dose massima tollerabile di sostanze chimiche terapeutiche nell'occhio. A dimostrare la procedura sarà Nijani Nagaarudkumaran, un ricercatore del Jones Laboratory.
Inizia posizionando sia i pHCEC che gli iHCEC su piastre di Petri rivestite di collagene con coperchio inferiore in vetro scivola a una concentrazione di 1 x 10 al 5 ° con 1 millilitro di mezzo epitelio oculare umano o HOEM. Coltiva pHCEC e iHCEC 1 set di colture per 24 ore e un altro set per 48 ore in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Dopo l'incubazione, colorare le cellule con 500 microlitri di soluzione tampone colorante di annessina contenente 4 calceina micromolare, 8 omodimero di etidio micromolare 1 e annessina 5 per 20 minuti a 37 gradi Celsius.
Dopo aver colorato le cellule, regolare il microscopio a scansione laser confocale per catturare le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione, come descritto nel manoscritto testuale. Ottenere le immagini bidimensionali e tridimensionali seguendo le istruzioni contenute nel manoscritto. Seminare le cellule a 5 x 10 al 4 ° per millilitro di HOEM in ciascun pozzetto di una piastra di coltura rivestita di collagene 1 a 24 pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 3 ore.
Dopo l'incubazione, ridurre il volume del mezzo nei pozzetti a 300 microlitri. Successivamente, esporre le cellule alle radiazioni UVA a 6,48 watt per metro quadrato e alle radiazioni UVB a 1,82 watt per metro quadrato a 37 gradi Celsius per 5 e 20 minuti in esperimenti separati. Dopo la radiazione UV, aggiungere 200 microlitri di HOEM fresco a ciascun pozzetto e incubare per 20 ore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.
Il giorno dopo, raccogliere il surnatante cellulare in ciascun pozzetto e trasferirlo in tubi sterili di polipropilene da 2 millilitri. Congelare il surnatante a meno 80 gradi Celsius. Per determinare i livelli di citochine rilasciati dai pHCEC e dagli iHCEC dopo l'esposizione ai raggi UV, utilizzare un test multiplex delle citochine e seguire le istruzioni del kit per quantificare l'interleuchina 6, l'interleuchina 8, l'interleuchina-1 beta e il TNF-alfa.
Preparare il 10% di reagente di dosaggio metabolico in DMEM e F12. Sostituire il terreno di coltura in ciascun pozzetto con 1 millilitro della soluzione di dosaggio metabolico al 10% e incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per 4 ore. Misurare la fluorescenza di ciascuna soluzione utilizzando un lettore di piastre fluorescenti a 530 nanometri di eccitazione e 590 nanometri di lunghezza d'onda di emissione.
Cellule di seme a 5 x 10 al quarto per millilitro di HOEM in ciascun pozzetto di una piastra di coltura rivestita di collagene 1 a 24 pozzetti. Incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per 3 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere il mezzo ed esporre le cellule a 1 millilitro di tossine chimiche, che includono 0,001% benzalconio cloruro, o BAK, 0,01% perossido di idrogeno e 0,0025% sodio dodecilsolfato in PBS per 5 e 15 minuti.
Dopo l'esposizione alle tossine chimiche, rimuovere le tossine dai pozzetti, risciacquare con 1 millilitro di PBS e aggiungere 1 millilitro di HOEM a ciascun pozzetto. Dopo 20 ore di incubazione, eseguire un test metabolico sostituendo il mezzo con 1 millilitro di una soluzione di dosaggio metabolico al 10% e incubando a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per 4 ore. Misurare la fluorescenza di ciascuna soluzione utilizzando un lettore di piastre fluorescenti a 530 nanometri di eccitazione e 590 nanometri di lunghezza d'onda di emissione.
Trasferire i surnatanti cellulari dai pozzetti dopo l'incubazione di 20 ore in tubi sterili separati di polipropilene da 2 millilitri e congelarli a meno 80 gradi Celsius. Utilizzare la stessa piattaforma multiplex utilizzata per valutare le citochine dalle cellule trattate con UV seguendo le istruzioni del kit per quantificare l'interleuchina 6, l'interleuchina 8, l'interleuchina-1 beta e il TNF-alfa. Cellule di seme a 1 x 10 al 5 ° per millilitro di HOEM in ciascun pozzetto di una piastra di coltura rivestita di collagene 1 a 24 pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 24 ore.
Dopo l'incubazione, rimuovere il mezzo ed esporre le cellule a 1 millilitro di tossine chimiche, tra cui 0,001% BAK, 0,005% BAK e 0,01% BAK in PBS per 5 minuti. Dopo l'esposizione, rimuovere le tossine chimiche, sciacquare i pozzetti con 1 millilitro di PBS e aggiungere 1 millilitro di HOEM a ciascun pozzetto. Dopo 20 ore di incubazione, colorare le cellule con 500 microlitri di soluzione tampone colorante di annessina contenente calceina, omodimero di etidio e annessina 5 per 20 minuti a 37 gradi Celsius.
Regolare il microscopio per misurare le intensità a lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di 630 e 675 nanometri per l'annessina 5, 495 e 515 nanometri per la calceina AM e 528 e 617 nanometri per la colorazione dell'etidio 1. Quindi acquisire immagini delle cellule utilizzando il microscopio a fluorescenza. Gli iHCEC sono risultati essere piccole cellule che vanno da 10 a 20 micrometri e i pHCEC erano nell'intervallo da 20 a 50 micrometri dopo 24 ore di crescita.
Differenze simili nell'intervallo di dimensioni sono state osservate per iHCEC e pHCEC dopo 48 ore di crescita. Rispetto alle cellule esposte ai raggi non UV, l'attività metabolica dei pHCEC irradiati è stata significativamente ridotta a 20 minuti di esposizione. Per gli iHCEC, l'attività metabolica è diminuita per le cellule irradiate sia a 5 che a 20 minuti.
Pertanto, ci è voluto un tempo di esposizione più lungo per ridurre l'attività metabolica dei pHCEC rispetto agli iHCEC. Il massimo rilascio di citochine da parte degli iHCEC è stato a 5 minuti di esposizione ai raggi UV. Il massimo rilascio di citochine per i pHCEC si è verificato a 20 minuti di esposizione ai raggi UV.
In termini di quantità totale di citochine infiammatorie rilasciate, i pHCEC hanno rilasciato sostanzialmente più interleuchina-1 beta, interleuchina 8 e TNF-alfa rispetto agli iHCEC, mentre gli iHCEC hanno rilasciato più interleuchina 6. Sia i pHCEC che gli iHCEC hanno mostrato un cambiamento nel rilascio di interleuchina 6 dopo l'esposizione a tutte e tre le sostanze chimiche. BAK ha causato una diminuzione del rilascio di interleuchina 6 rispetto al controllo sia per gli HCEC primari che per quelli immortalizzati.
Il perossido di idrogeno ha causato un aumento del rilascio di interleuchina 6 dagli iHCEC e una diminuzione del rilascio dai pHCEC. Sia i pHCEC che gli iHCEC sono stati significativamente danneggiati allo 0,005% e allo 0,1% di BAK. Dopo aver eseguito valutazioni in vitro della tossicità delle cellule oculari, potrebbero essere intrapresi ulteriori modelli animali di tossicità oculare per determinare l'effetto di un prodotto oculare sui nervi corneali o sul sistema immunitario oculare.
Queste tecniche sono essenziali per determinare i meccanismi di tossicità chimica e di formulazione del prodotto sull'occhio e aiuteranno a ridurre al minimo l'uso di animali per i test di sviluppo del prodotto.
