Ringraziamo la facoltà, borsisti, i residenti, e assistenti medici del Brigham and Women Hospital, il Dipartimento di Patologia per rendere i tessuti disponibili per questi studi. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi di ricerca del NIH / National Cancer Institute (CA105009 P50, K08 CA108748, U01 CA152990), Cancer Research Fund ovarico, Il maggio Kay Foundation, Novartis Pharmaceuticals, Robert e Deborah primo fondo, Randi e Joel cancro ovarico Cutler Fondo di ricerca, Marsha Rivkin Fondazione - Scholar Award scientifico, AACR - George e Patricia Sehl Fellowship for Cancer Genetics della Ricerca e della Compagnia medico americano per la medicina in Israele - Claire e Emmanuel G. Rosenblatt Foundation Grant.

1. Collagene Preparazione e rivestimento del filtro. <ol><li> Per preparare collagene umano placentare, tweeze da 30 mg di collagene umano placentare e messo al di sopra di 50 ml di acqua distillata (dH 2 O) in un bicchiere da 500 ml con ancoretta. </li><li> Aggiungere 100 μls di acido acetico glaciale direttamente sul collagene per rendere più facile a dissolversi. Calda a 37 ° C e mescolate per sciogliere il collagene. Deve sciogliere in 20-30 minuti. Se filamenti di collagene rimangono in soluzione, la sterilizzazione del filtro sarà difficile. </li><li> Diluire il magazzino 50 ml con 450 ml di dH 2 O e filtro sterilizzare con una membrana di 0,2 micron. Questa è la soluzione finale di lavoro. Conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare membrane Transwell filtro rivestendoli con collagene (50-100 mL) durante la notte. Collagene refrigerata deve essere riscaldato a RT e poi aggiunto al vano superiore per coprire la membrana durante la notte ed a temperatura ambiente. Prima di placcatura il dissociato tubo primario di Falloppio (FT) epitelio (vedi sotto) sulla filtri Transwell, lavare i filtri per tre volte in 1X tampone fosfato salino (PBS) almeno 1 ora prima dell&#39;uso per rimuovere l&#39;eccesso di collagene. </li></ol> 2. Tessuto Raccolta e dissociazione. <ol><li> Fresco tube di Falloppio (FT) fimbria deve essere raccolto in sterili 1X PBS in un tubo da centrifuga da 50 ml e tenuta in ghiaccio prima della richiesta di elaborazione in una cappa sterile coltura di tessuti. </li><li> Lavare il campione di tessuto, una volta raffreddata in 20 ml di PBS 1X (se il campione è stato raccolto in un altro tipo di supporto o lavare sanguinosa almeno 3 volte di liberarsi di come molto sangue e dei media stranieri il più possibile in quanto ciò potrebbe interferire con l&#39;efficienza placcatura). </li><li> Utilizzando una pinzetta sterile FT trasferimento ad un piatto della cultura 10 centimetri di tessuto con un po &#39;di PBS e, utilizzando una pinzetta sterile bisturi e sterile, tagliato longitudinalmente per massimizzare l&#39;esposizione delle cellule epiteliali. Aprire la fimbria in modo che non è più un tubo, ma un foglio quasi piatto di tessuto. Poi tagliato in pezzi più piccoli, ma ancora recuperabili (circa 3 mm di diametro). </li><li> Trasferimento pezzi da 45 ml di acqua refrigerata dissociazione media (MEM contenente 1,4 mg / ml pronasi e 0,1 mg / ml di DNAsi) in una provetta da 50 ml. </li><li> Roccia dolcemente a 4 ° C per 24 a 72 ore. (Per esperienza, 48 ore è ottimale). Per controllare quantità di dissociazione, mettere una goccia di dissociazione dei media su un vetrino e controllare quantità di aggregazione e di vitalità del tessuto (battendo cellule ciliate). Vuoi vedere entrambe le celle singole e alcune macchie di piccole dimensioni. </li></ol> 3. Tubo placcatura di Falloppio. <ol><li> Quando la quantità di dissociazione delle cellule epiteliali è ottimale, inattivare i media aggiungendo il 10% del volume di FBS. Invertire un paio di volte per rimuovere la sospensione cellulare in piccoli aggregati. </li><li> Lasciare grumi di tessuto di grandi dimensioni (tessuto stromale) a stabilirsi sul fondo della provetta. Rimuovere i supporti contenenti le cellule epiteliali in un secondo tubo da 50 ml. </li><li> Aggiungere 50 ml di MEM freddo (senza FBS) per l&#39;originale tubo da 50 ml. Inverti per raccogliere le cellule aggiuntivi. Raccogliere i media in un terzo tubo da 50 ml (se il campione è molto grande e un elevato numero di cellule è previsto, questo passaggio può essere ripetuto per massimizzare la raccolta delle cellule). Le grandi pezzi di tessuto stromale / extracellulare può essere scartata. Ora avete due provette da 50 ml di sospensione cellulare. Centrifugare a 1000 rpm per 5 minuti e aspirare i media dissociazione da pellet cellulari. </li><li> Risospendere in circa 5-10 ml di USG media (DMEM: F12 integrato con il 2% e 1% USG Pen Strep) riscaldato a 37 ° C. Pipettare delicatamente. Fare attenzione a non pipetta anche con forza, poiché ciò potrebbe danneggiare le cellule epiteliali e ridurre la qualità delle culture. Ci dovrebbe essere celle singole e piccoli grumi (Figura 1). </li><li> Trasferimento su piatti cultura Primaria e incubare per un minimo di 1 ora o fino a 3 ore. Fibroblasti e cellule rosse del sangue si attacca alla plastica, ma le cellule epiteliali FT non lo faranno. Date un&#39;occhiata al piatto dopo un&#39;ora per vedere se qualcosa è attaccare. La presenza di cellule ciliate può essere visto da notare il battito delle ciglia. </li><li> Durante questa incubazione, filtri collagene rivestito può essere lavato e pronto per placcatura cella (vedi punto 1.4) </li><li> Dopo 1-3 ore di incubazione sulle piastre Primaria, trasferire la sospensione di cellule in una provetta da 15 ml e lavare la piastra Primaria con 5 ml di USG media, trasferire questo supporto al tubo per rendere un volume finale di 15 ml. Centrifugare a 1000 rpm per 5 minuti. </li><li> Attenzione dei media e aspirare evitare di perturbare il pellet. A giudicare dalle dimensioni pellet, risospendere in quantità appropriata di USG media. (Di solito tra ml 1-3) Meno è meglio all&#39;inizio in modo che si possa diluire ulteriormente se necessario. Risospendere delicatamente. </li><li> Aggiungere 10 ml di cellule risospese ad una emocitometro e determinare la densità cellulare. Suggerimenti: Siete alla ricerca di cellule epiteliali che hanno una membrana cellulare decisamente scuro e non sono colonnare. Si può anche contare le cellule ciliate che sono decisamente in movimento. Celle più piccole che hanno un alone appearance sono i globuli rossi e non devono essere conteggiati. Ci saranno alcune aggregazione, quindi è necessario stimare che in te conta delle cellule. Il target semina è 1,65 x10 5 cellule / a membrana, o almeno il 75% di copertura del filtro (Figura 1). Se le cellule sono placcati troppo poco, le cellule non saranno in grado di formare uno strato epiteliale completa. </li><li> Aggiungere 500 l di media USG al fondo del pozzetto di una piastra ben 24 e inserire Transwell. Il volume di sospensione cellulare FT (vedi sopra) possono essere aggiunti su ogni membrana, questo è in genere 100 ul. </li><li> Incubare e far crescere per 1-2 giorni senza disturbare superiore della membrana. È possibile modificare il supporto sul lato basale in quei giorni se necessario. Dopo 1-2 giorni, è possibile lavare accuratamente la superficie con USG media e aggiungere una piccola quantità (50-100 mL) dei media sulla parte superiore della membrana. E &#39;più facile determinare la confluenza di colture cellulari se il supporto viene rimosso dalla parte apicale dei filtri prima di microscopia. Lo scomparto inferiore deve sempre contenere i media. Una volta che le culture sono completamente confluenti (di norma entro 5 giorni), la quantità di materiale che viaggia attraverso i filtri dal basale ai lati apicale dovrebbe essere trascurabile. </li><li> Cambiare il supporto basale una volta ogni due giorni per i primi 10 giorni. Lo scomparto inferiore deve sempre avere un supporto per mantenere le cellule vive. Una volta che le cellule hanno formato uno strato epiteliale stretto (Figure 1 e 2) possono essere utilizzati in ulteriori studi, come immunofluorescenza (IF) o immunoistochimica (IHC). </li></ol> 4. Membrana di elaborazione. <ol><li> Elaborazione membrana dipende dal tipo di studio che verrà eseguita, ma in genere comporta la rimozione del filtro da inserti Transwell. </li><li> I filtri sono normalmente lavati 3 volte in 200 ml di PBS 1X prima della rimozione. </li><li> Aspirare il PBS da parte apicale e basale dei filtri. Questo dovrebbe essere fatto 1 vasca alla volta per evitare che le membrane si secchi. </li><li> Rimuovere l&#39;inserto dalla piastra, lancia a testa in giù e usare un bisturi sterile per tagliare intorno alla membrana. Tenta di rimuovere la membrana in un unico pezzo mediante tagli dritti lungo il bordo della membrana, invece di trascinare il bisturi intorno al bordo. </li><li> Utilizzare le pinzette per rimuovere il filtro dal inserto, tenere traccia di quale lato le cellule sono in. Il filtro può quindi essere trattati per IF, IHC, ecc a seconda dei casi. </li><li> Esempio: per IF studi, il filtro (dopo la fissazione, permeabilizzazione, il blocco e l&#39;incubazione con gli anticorpi del caso, secondo le procedure standard IF) deve essere immesso in una diapositiva, le cellule rivolto verso l&#39;alto Vectashield con DAPI è caduto sul filtro e coperto con un vetro coprioggetto. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: I filtri transwell può essere facilmente rimosso per esaminare l&#39;epitelio ex vivo da entrambi i immunoistochimica (IHC) e di immunofluorescenza (IF). Utilizzando lignaggio marcatori specifici, si può immagine e quantificare i secretoria (PAX8 positivo) e ciliate (Sall2 positivo) compartimenti cellulari in queste culture (Figura 3). Inoltre, utilizzando questi indicatori, si può monitorare ogni tipo di cellula risponde a diversi stimoli fisiologici 10. Questo sistema è stato utilizzato per caratterizzare i cambiamenti nel phosphoproteome secretome e intracellulare di epitelio FT in risposta a stimoli diversi. <img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Illustrazione raffigura come ex culture vivo sono generati dalla scuola primaria tessuti umani tuba di Falloppio. Tessuti tuba fimbrial è ottenuto dalla sala operatoria e tritate per generare piccoli frammenti 1, che vengono lavate e incubate con dissociazione dei media per 24-72 ore 2. Dopo la dissociazione è completa, i frammenti di tessuto sono lasciati depositare in fondo al tubo di incubazione e che i supporti contenenti le cellule epiteliali dissociate viene raccolto 3. L&#39;efficienza di dissociazione può essere monitorato con l&#39;esame al contrasto di fase 4 microscopio. Le cellule epiteliali dissociate vengono poi coltivate in piastre Primaria per contribuire a rimuovere fibroblasti e cellule ematopoietiche che invariabilmente mescolati con le cellule epiteliali 5. Una volta che il non-epiteliali cellule siano adeguatamente rimossi, le cellule epiteliali sono seminate su filtri transwell che sono rivestite di collagene umano placentare 5. Il supporto è fornito per diffusione attraverso la transwell dal basso. Le colture vengono incubate per 24-48 ore e poi i media apicale è stato rimosso. Le colture ex vivo sono poi permesso di crescere per 5-8 giorni per formare un completo, prato completa sui filtri transwell. Le culture ex vivo può essere mantenuto in questo stato validamente per un massimo di 4 settimane. Il cartone animato 5 mostra una rappresentazione della cultura completamente cresciuto ex vivo con un esempio di un filtro rimosso dalla inserire e macchiato di ematoxylin e eosina (H &amp; E) per dimostrare la polarità e l&#39;architettura dell&#39;epitelio ex vivo. <img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Microscopia in campo chiaro di FT ex culture vivo. Transwell inserti sono rivestiti con pori collagene umano placentare 0.4μm sono visibili (a). FT cellule epiteliali sono coltivate sul collagene inserti rivestiti (b), dove formano uno strato epiteliale (c). Alcuni detriti è normalmente osservato aderire alle cellule epiteliali della cultura (indicato dalle frecce), più spesso per le cellule ciliate. <img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. FT ex vivo della cultura di immunofluorescenza (IF). Esempi di IF immagini di culture ex vivo fissate e colorate con anticorpi contro (a) secretoria (PAX8) e (d) delle cellule ciliate (Sall2) i marcatori. DAPI viene utilizzato come controllo per la localizzazione dei nuclei cellulari (blu) (b ed e) e degli anticorpi fusi e colorazione DAPI è anche mostrato (C e F). Il numero delle cellule dipende dalla lunghezza del tempo le cellule sono in coltura (PAX8 colorazione, 7 giorni; Sall2 colorazione, 3 giorni).

<ol>
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Dr. Drapkin è un consulente di Novartis Pharmaceuticals. Nessun altri autori dichiarare eventuali conflitti di interesse.

L&#39;identificazione del FT come un sito candidato di origine per SOC offre l&#39;opportunità di ricerca di base e traslazionale volti a decifrare i meccanismi che collegano noti fattori di rischio e l&#39;attuale processo di sierosa cancerogeni. Critico per questo è lo sviluppo di sistemi modello docile che ci permetterà di iniziare a testare l&#39;ipotesi che l&#39;FTSEC è una cella di origine per pelvico carcinomi sierosi. L&#39;ex modello di cultura vivo qui descritto è un nuovo sistema che permette l&#39;isolamento e la co-coltura di secretoria FT primarie e cellule ciliate in un modo che preservi la morfologia e la biologia dell&#39;epitelio FT nativi. Utilizzando questo sistema, abbiamo recentemente caratterizzato il secretome di questo epitelio e come l&#39;epitelio risponde al danno meccanico e genotossico 10. L&#39;ovulazione, un importante fattore di rischio associato a tumorigenesi ovarico, è caratterizzato da una combinazione di danno tissutale, mediatori infiammatori, fattori di crescita e ormoni 11. Questo sistema potrebbe essere usato per studiare l&#39;effetto di un ambiente ovulatoria sulla risposta e la vitalità delle cellule ciliate e secretorie. Inoltre, l&#39;impatto di altri tipi di cellule (cellule infiammatorie ad esempio) potrebbe essere esaminate per consentire una migliore comprensione degli eventi che determinano la differenziazione delle cellule di tipo ei fattori che contribuiscono alla trasformazione neoplastica delle cellule. Modelli simili sono stati descritti in altri tessuti dove epitelio polarizzato è presente. Per esempio, nel polarizzata colture primarie di epitelio delle vie aeree, l&#39;effetto di heregulin sulla crescita cellulare e la risposta al danno cellulare è stata valutata 12. Questi tipi di sistemi modello forniscono un modo nuovo e utile per studiare l&#39;inizio e la patogenesi dei tumori che derivano da tessuti epiteliali, e questo è di importanza critica in tessuti come il Financial Times in cui non esistono attualmente linee cellulari, e dove c&#39;è una grande necessità per l&#39;individuazione di percorsi principali e lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Collagen from human placenta (Bornstein and Traub Type IV)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C7521</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM:F12 media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>15-090-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultroser G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Crescent Chemical Company</td>
<td>67042</td>
<td>Add 20 ml of DMEM:F12 to stock bottle and use 10mls per 500 ml of media (2% final concentration)</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Primaria culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>353802</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24 well Transwell Permeable supports</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning (Costar)</td>
<td>3470</td>
<td> Clear, 6.5 mm insert, 0.4 &mu;m pore size, treated polyester </td>
</tr>
<tr>
<td>MEM (Minimal Essential Media)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pronase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11459643001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNAse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>DN25</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sall2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dr T. Benjamin, Harvard</td>
<td>Gift</td>
<td>1:20 dilution</td>
</tr>
<tr>
<td>Pax8 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Proteintech</td>
<td>10336-1-AP</td>
<td>1: 1000 dilution</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

ex vivo culture of primary human fallopian tube epithelial cells

Carcinoma ovarico epiteliale è una delle principali cause di mortalità per tumore femminile negli Stati Uniti. A differenza di altre donne-specifici tumori, come il carcinoma della mammella e dell&#39;utero, in cui i tassi di mortalità sono diminuiti negli ultimi anni, i tassi di curare il cancro ovarico sono rimasti relativamente invariati negli ultimi due decenni 1. Ciò è dovuto alla mancanza di adeguati strumenti di screening per la rilevazione di malattia in stadio precoce, dove la chirurgia e la chemioterapia sono più efficaci 2, 3. Di conseguenza, la maggior parte dei pazienti presentano con malattia in stadio avanzato e diffuso coinvolgimento addominale. Questo è ulteriormente complicato dal fatto che il cancro ovarico è una malattia eterogenea con più sottotipi istologici 4, 5. Carcinoma ovarico sieroso (SOC) è il sottotipo più comune e aggressivo e la forma più spesso associata a mutazioni nei geni BRCA. Attuali modelli sperimentali in questo campo prevedono l&#39;utilizzo di linee cellulari tumorali e modelli di mouse per capire meglio gli eventi iniziare genetica e la patogenesi della malattia 6, 7. Recentemente, le tube di Falloppio è emerso come un sito innovativo per l&#39;origine della SOC, con le tube di Falloppio (FT) secretoria delle cellule epiteliali (FTSEC) come la cellula di origine proposto 8, 9. Attualmente non ci sono linee cellulari o sistemi di coltura a disposizione per studiare l&#39;epitelio FT o il FTSEC. Qui si descrive un nuovo sistema ex vivo cultura in cui sono coltivate le cellule primarie FT epiteliali umane in un modo che preservi la loro architettura, polarità, immunofenotipo, e la risposta a fattori di stress fisiologico e genotossico. Questo modello ex vivo fornisce un utile strumento per lo studio della SOC, permettendo una migliore comprensione di come i tumori possono derivare da questo tessuto, ei meccanismi coinvolti nella progressione del tumore e di iniziazione.

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Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Le tube di Falloppio (FT) sta emergendo come un sito alternativo di origine per il carcinoma ovarico sieroso (SOC). Questo protocollo descrive un nuovo metodo per l&#39;isolamento e la<em&gt; Ex vivo</emCultura&gt; delle cellule epiteliali tube di Falloppio. Questo sistema racchiude in sintesi il<em&gt; In vivo</emEpitelio&gt; e permette lo studio della patogenesi SOC.

Ex Cultura Vivo di cellule primarie umane tube di Falloppio epiteliale

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

ex-vivo-culture-of-primary-human-fallopian-tube-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

19.6K Views.  Dana-Farber Cancer Institute. Le tube di Falloppio (FT) sta emergendo come un sito alternativo di origine per il carcinoma ovarico sieroso (SOC). Questo protocollo descrive un nuovo metodo per l'isolamento e la Ex vivo delle cellule epiteliali tube di Falloppio. Questo sistema racchiude in sintesi il In vivo e permette lo studio della patogenesi SOC.

Video: Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Metodo per la Cultura di Chick primi embrioni ex vivo (Nuova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Ricerca

Biologia

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the function and structure of human epithelial cells. Here we describe in detail the method of growing bronchial epithelial cells from bronchial airway tissue that is harvested by the surgeon at the times of lung surgery (e.g. lung cancer or lung volume reduction surgery). With ethics approval and informed consent, the surgeon takes what is needed for pathology and provides us with a bronchial portion that is remote from the diseased areas. The tissue is then used as a source of explants that can be used for growing primary bronchial epithelial cells in culture. Bronchial segments about 0.5-1cm long and &le;1cm in diameter are rinsed with cold EBSS and excess parenchymal tissue is removed. Segments are cut open and minced into 2-3mm3 pieces of tissue. The pieces are used as a source of primary cells. After coating 100mm culture plates for 1-2 hr with a combination of collagen (30 &mu;g/ml), fibronectin (10 &mu;g/ml), and BSA (10 &mu;g/ml), the plates are scratched in 4-5 areas and tissue pieces are placed in the scratched areas, then culture medium (DMEM/Ham F-12 with additives) suitable for epithelial cell growth is added and plates are placed in an incubator at 37&deg;C in 5% CO2 humidified air. The culture medium is changed every 3-4 days. The epithelial cells grow from the pieces forming about 1.5 cm diameter rings in 3-4 weeks. Explants can be re-used up to 6 times by moving them into new pre-coated plates. Cells are lifted using trypsin/EDTA, pooled, counted, and re-plated in T75 Cell Bind flasks to increase their numbers. T75 flasks seeded with 2-3 million cells grow to 80% confluence in 4 weeks. Expanded primary human epithelial cells can be cultured and allowed to differentiate on air-liquid interface. Methods described here provide an abundant source of human bronchial epithelial cells from freshly isolated tissues and allow for studying these cells as models of disease and for pharmacology and toxicology screening.

Here we describe a detailed method for growing primary human bronchial epithelial cells from explants of human bronchial airway tissue including differentiated growth on an air-liquid interface. This method provides an abundant source of primary cells for investigating the role of the airway epithelium in human lung health and disease.

Primario cellule epiteliali bronchiali umane Grown da espianti

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolamento e la coltura di cellule staminali epiteliali da pelle umana

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentivirali-mediata Knockdown Durante Ex Vivo</emEritropoiesi> di cellule staminali emopoietiche

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

Ex vivo Cultura embrionali di topo della pelle e live-imaging delle Migrazioni Melanoblast

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of airway cell differentiation and function. In the past few years, the use of lentiviral vectors for transgene delivery became common practice. While there are reports of transduction of fully differentiated airway epithelial cells with certain non-HIV pseudo-typed lentiviruses, the overall transduction efficiency is usually less than 15%. The protocol presented here provides a reliable and efficient method to produce lentiviruses and to transduce primary human bronchial epithelial cells. Using undifferentiated bronchial epithelial cells, transduction in bronchial epithelial growth media, while the cells attach, with a multiplicity of infection factor of 4 provides efficiencies close to 100%. This protocol describes, step-by-step, the preparation and concentration of high-titer lentiviral vectors and the transduction process. It discusses the experiments that determined the optimal culture conditions to achieve highly efficient transductions of primary human bronchial epithelial cells.

Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.

Ottimale Lentivirus di produzione e colture cellulari condizioni necessarie al successo le cellule trasdurre primario dell&#39;uomo epiteliali bronchiali

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II cells and two types of immune cells (i.e., human monocyte-derived macrophages [MDMs] and dendritic cells [MDDCs]). A protocol for assembling the multicellular model is provided. Alveolar epithelial cells (A549 cell line) are grown and differentiated under submerged conditions on permeable inserts in two-chamber wells, then combined with differentiated MDMs and MDDCs. Finally, the cells are exposed to an air-liquid interface for several days. As human primary immune cells need to be isolated from human buffy coats, immune cells differentiated from either fresh or thawed monocytes are compared in order to tailor the method based on experimental needs. The three-dimensional models, composed of alveolar cells with either freshly isolated or thawed monocyte-derived immune cells, show a statistically significant increase in cytokine (interleukins 6 and 8) release upon exposure to proinflammatory stimuli (lipopolysaccharide and tumor necrosis factor &#945;) compared to untreated cells. On the other hand, there is no statistically significant difference between the cytokine release observed in the cocultures. This shows that the presented model is responsive to proinflammatory stimuli in the presence of MDMs and MDDCs differentiated from fresh or thawed peripheral blood monocytes (PBMs). Thus, it is a powerful tool for investigations of acute biological response to different substances, including aerosolized drugs or nanomaterials.

Presented here is a protocol for primary human blood monocyte isolation as well as their differentiation into macrophages and dendritic cells and assembly with epithelial cells into a multicellular human lung model. Biological responses of cocultures composed of immune cells differentiated from either freshly isolated or thawed monocytes, upon exposure to proinflammatory stimuli, are compared.

Modello alveolare umano multicellulare composto da cellule epiteliali e cellule immunitarie primarie per la valutazione del pericolo

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

Isolamento e arricchimento di cellule progenitrici epiteliali polmonari umane per la coltura di organoidi

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a multifactorial disease influenced by environmental and genetic factors, which lead to functional impairment of the retina due to retinal pigment epithelial (RPE) cell degeneration followed by photoreceptor degradation. An ideal treatment would include the transplantation of healthy RPE cells secreting neuroprotective factors to prevent RPE cell death and photoreceptor degeneration. Due to the functional and genetic similarities and the possibility of a less invasive biopsy, the transplantation of iris pigment epithelial (IPE) cells was proposed as a substitute for the degenerated RPE. Secretion of neuroprotective factors by a low number of subretinally-transplanted cells can be achieved by Sleeping Beauty (SB100X) transposon-mediated transfection with genes coding for the pigment epithelium-derived factor (PEDF) and/or the granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF). We established the isolation, culture, and SB100X-mediated transfection of RPE and IPE cells from various species including rodents, pigs, and cattle. Globes are explanted and the cornea and lens are removed to access the iris and the retina. Using a custom-made spatula, IPE cells are removed from the isolated iris. To harvest RPE cells, a trypsin incubation may be required, depending on the species. Then, using RPE-customized spatula, cells are suspended in medium. After seeding, cells are monitored twice per week and, after reaching confluence, transfected by electroporation. Gene integration, expression, protein secretion, and function were confirmed by qPCR, WB, ELISA, immunofluorescence, and functional assays. Depending on the species, 30,000-5 million (RPE) and 10,000-1.5 million (IPE) cells can be isolated per eye. Genetically modified cells show significant PEDF/GM-CSF overexpression with the capacity to reduce oxidative stress and offers a flexible system for ex vivo&#160;analyses and in vivo studies transferable to humans to develop ocular gene therapy approaches.

Here, a protocol to isolate and transfect primary iris and retinal pigment epithelial cells from various mammals (mice, rat, rabbit, pig, and bovine) is presented. The method is ideally suited to study ocular gene therapy approaches in various set-ups for ex vivo&#160;analyses and&#160;in vivo studies transferable to humans.

Isolamento, coltura e ingegneria genetica delle cellule epiteliali pigmentate primarie dei mammiferi per la terapia genica non virale

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Dissezione e coltura efficienti delle cellule epiteliali del pigmento retino del topo primario

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...