Questo protocollo consente a chiunque di condurre esperimenti FRET a singola molecola per misurare distanze assolute accurate all'interno di biomolecole utilizzando smfBox, che è uno strumento economico, robusto e open source. smFRET consente di guardare una molecola alla volta, piuttosto che la media di molti miliardi di molecole, in modo da poter caratterizzare le diverse conformazioni che adottano. La bellezza di questo metodo è che potrebbe essere utilizzato per far luce sulla struttura e la dinamica di molti sistemi biomolecolari.
Ad esempio, il ripiegamento delle proteine, le interazioni del DNA proteico e l'allosteria del DNA. Prima di iniziare un'analisi, avviare il centro di controllo laser e verificare che sia selezionata la modalità a corrente costante alternata a onda continua. Accendere entrambi i laser.
Avviare il software di acquisizione smOTTER e verificare che ogni strumento sia configurato correttamente. Per allineare il percorso di emissione, posizionare una goccia di olio per immersione sull'obiettivo e posizionare con cura un vetro di copertura pulito sulla lente dell'obiettivo, abbassandolo ad angolo rispetto all'olio per evitare di intrappolare bolle d'aria tra il vetro di copertura e l'obiettivo. Quindi aggiungere 10 microlitri di colorante Cy3B nanomolare 100 nanomolari al centro del vetro di copertura.
Nel pannello dei cicli di lavoro laser, impostare il laser del donatore su zero off, 45 on e 55 off. Impostare il laser dell'accettore su 50 spento, 45 acceso e cinque spento. Impostare l'eccitazione laser alternata o il periodo ALEX su 100 microsecondi.
Apri la scheda Messa a fuoco Z. Nel pannello di acquisizione, sposta i laser in diretta e avvia la fotocamera. Regolate l'esposizione in modo che un punto luminoso appaia circondato centralmente da uno sfondo nero.
Partendo da una posizione Z bassa, aumentare l'altezza fino a quando il punto luminoso raggiunge la sua dimensione minima. Quindi aumentare l'altezza fino a ulteriori 20 micrometri per focalizzare il laser nel campione sopra l'olio e coprire il vetro. Quando il campione viene messo a fuoco, arrestare la fotocamera.
Nel centro di controllo dell'omicrone, abbassare la potenza del laser verde mentre si monitora la scala dell'asse y nella scheda di allineamento di smOTTER fino a quando non viene osservata la lettura da entrambi i rivelatori, modificando la scala secondo necessità. Quindi svitare le quattro viti nella parte anteriore dello smfBox per rimuovere il pannello frontale. Per allineare il foro stenopeico, ruotare la manopola X sul posizionatore stenopeico mentre si osserva il segnale sulla linguetta di allineamento per aumentare il segnale in verde e rosso.
Ruotare la manopola Y per allineare il foro stenopeico nella direzione opposta, quindi tornare alla manopola X per verificare eventuali ulteriori aumenti di segnale. Per allineare l'obiettivo stenopeico, ruotare la manopola X dell'obiettivo in una direzione per diminuire il segnale, quindi ruotare la manopola X stenopeica nella stessa direzione per riportare il segnale al livello originale. Se il nuovo segnale massimo è più alto di prima, continua a spostare iterativamente sia il foro stenopeico che le manopole dell'obiettivo in quella direzione.
Se il segnale è inferiore a prima, spostare iterativamente le manopole nella direzione opposta, quindi ripetere l'allineamento utilizzando le manopole Y stenopeiche e lente. Per l'allineamento della lente del fotodiodo a valanga, a partire dal fotodiodo della valanga verde, spostare la manopola X fino a quando il segnale verde è al massimo. Ripetere la modifica del segnale per la manopola Y.
Torna alla manopola X, spostandoti avanti e indietro per trovare i punti di soglia in cui il segnale inizia a cadere. Lasciare il segnale in una posizione a metà strada tra questi due punti. Trova la posizione a metà strada per la manopola Y e ripeti l'allineamento per il fotodiodo della valanga rossa.
Prima di analizzare il primo campione, pulire lo stadio con tessuto per la pulizia delle lenti imbevuto di metanolo, pulendo delicatamente l'obiettivo da un'estremità all'altra e applicare da tre a quattro gocce di olio per immersione sul centro dell'obiettivo. Aggiungere 10 microlitri di acqua ultrapura di tipo uno al centro di un vetro di copertura pulito e monitorare la traccia d'acqua per confermare che non si osservano segnali fluorescenti. Quindi utilizzare pinzette di gomma per rimuovere con cura il vetro di copertura e ricostituire l'olio di immersione, se necessario.
Per garantire che si ottengano dati su una singola molecola, dopo aver diluito il campione, selezionare una concentrazione alla quale si osservino da uno a cinque scoppi al secondo nel pannello di traccia viva. Quando è stata determinata la concentrazione appropriata, premere isolatori di silicone da otto a nove millimetri di diametro sul centro di un nuovo vetro di copertura e aggiungere con attenzione 10 microlitri di campione al centro, evitando il contatto con il silicone. Posizionare saldamente il secondo vetro di copertura sugli isolatori fino a formare un sigillo.
Controllare la stechiometria dal vivo rispetto all'istogramma di efficienza FRET per osservare se il campione si sta comportando come previsto. Nel pannello delle impostazioni di salvataggio, immettere le informazioni relative al nome e ai dettagli del campione, alle etichette del donatore e dell'accettore, alle lunghezze d'onda di eccitazione del buffer, del donatore e dell'accettore, alle lunghezze d'onda di rilevamento e alla potenza del laser, all'utente finale e all'affiliazione dell'utente. Nel pannello di acquisizione, inserisci la durata dell'esperimento in minuti e seleziona un intervallo di salvataggio appropriato per mitigare qualsiasi potenziale perdita di dati in caso di errore.
Selezionare Salva potenze laser, se necessario, quindi fare clic su Avvia per iniziare ad acquisire i dati. In un risultato positivo, si otterrà tra cinque e una raffica al secondo. In un risultato negativo, si osserveranno troppe o troppo poche esplosioni nello stesso lasso di tempo.
Dopo la raccolta e l'analisi, il grafico di alternanza dovrebbe corrispondere al periodo ALEX della configurazione sperimentale. La traccia temporale viene utilizzata per valutare qualitativamente che la concentrazione del campione sia ragionevole. Il grafico di sfondo mostra la distribuzione dei periodi di ritardo inter-fotoni con un adattamento lineare ai tempi più lunghi per stimare il tasso di sfondo.
La traccia di sfondo può essere utilizzata per identificare se ci sono stati cambiamenti nel campione per tutta la durata dell'esperimento. Vengono generati istogrammi di stechiometria e efficienza FRET, selezionando per tutte le specie e le specie doppiamente etichettate. Un istogramma di efficienza FRET 1D viene generato con il fitting gaussiano dei dati.
Quindi la concentrazione del campione qui è la chiave. Se è troppo alto, non stai più facendo un esperimento a singola molecola, mentre se è troppo basso, ci vorrà troppo tempo per ottenere i dati. Ha permesso la determinazione di strutture di biomolecole dinamiche, che non possono essere determinate con altri metodi come la NMR o la cristallografia.
