Le funzioni delle proteine dipendono dalla temperatura e sono ottimali alla temperatura. Questo protocollo fornisce un modo per risolvere le strutture proteiche a temperature più elevate. Questo approccio può fornire strutture funzionalmente rilevanti e migliorare la comprensione della dipendenza dalla temperatura delle strutture proteiche.
A dimostrare la procedura sarà Yuan-Chih Chang, Manager della struttura Academia Sinica Cryo EM. Inizia facendo un foro di un centimetro in un tubo di centrifuga da 50 millimetri sulla sua estremità chiusa. Posizionare il tubo nella camera dell'apparato di vetrificazione all'uscita dell'acqua ad ultrasuoni.
Impostare la temperatura dell'apparecchio di vetrificazione alla temperatura specificata e consentire alla camera dell'apparecchio di vetrificazione di raggiungere 55 gradi Celsius e il 100% di umidità relativa. Lasciare riposare per almeno mezz'ora per stabilizzare le condizioni prima di iniziare l'esperimento. Posizionare il bagno d'acqua su una piastra riscaldante e impostare la piastra calda alla temperatura desiderata.
Controllare con un termometro per assicurarsi che l'acqua raggiunga i 55 gradi Celsius. Incubare il campione a bagnomaria e preriscaldare la punta della pipetta sul bordo della piastra riscaldante per due minuti o più prima dell'esperimento di blotting. Glow scarica una griglia supportata da carbonio holey a 25 milliampere per 30 secondi.
Posizionare la carta da filtro per vetrificazione nella camera dell'apparecchio di vetrificazione non prima di cinque minuti prima dell'esperimento di blotting. Incubare le pinzette con la griglia nell'apparecchio di vitrificazione per due minuti o più. Costruire il contenitore di etano con etano secondo le procedure standard, assicurandosi che l'etano non trabocchi.
Utilizzare una pipetta per applicare da sette a nove microlitri del campione alla griglia. Quindi attendere uno o due secondi, asciugare per uno o un secondo e mezzo e immergere rapidamente il campione nell'etano liquido. Trasferire la griglia dall'etano liquido alla crioscatola immagazzinata in azoto liquido.
Aggancia le griglie e scaricale per acquisire il microscopio elettronico o lo strumento Cryo EM. Utilizzare lo schermo dello strumento Cryo EM e la funzione a basso dosaggio del software, per schermare le condizioni del ghiaccio sulla griglia e la distribuzione del campione sulla griglia. Se la qualità della griglia risultante non è buona, ripetere il processo di preparazione della griglia con varie condizioni come tempi di attesa, tempi di asciugatura, eccetera.
Se la qualità della griglia risultante è buona, ripetere gli stessi passaggi per creare griglie a una temperatura diversa. Trasferisci le griglie di buona qualità su uno strumento Cryo EM ad alta risoluzione. Eseguire la raccolta e l'analisi dei dati secondo procedure stabilite.
Nel caso della griglia di successo, si è formato un gradiente di ghiaccio con ghiaccio più spesso in alto a sinistra della griglia e ghiaccio più sottile in basso a destra. Le caselle blu e verdi adatte alla raccolta dei dati sono state osservate nella griglia di successo. Un contrasto luminoso è stato osservato nell'altra griglia.
Indica uno strato sottile, di ghiaccio o un'assenza di ghiaccio. Solo due quadrati sono risultati adatti per la raccolta dei dati nella seconda griglia. Una delle griglie consisteva principalmente di ghiaccio sotto forma di cristallino, che non era adatto per la raccolta dei dati.
D'altra parte, l'altra griglia ha mostrato che lo strato di ghiaccio era per lo più in uno stato amorfo adatto alla raccolta dei dati. La preparazione del contenitore e degli altri deve essere completa in base a un punto temporale. Il controllo del tempo e la finitura dell'esperimento in modo rapido e preciso sono molto importanti.
A seconda dei risultati ottenuti utilizzando questo protocollo, il ricercatore potrebbe dover essere più attento nell'impostare le semplici condizioni.
