La microscopia crioelettronica a singola particella è il metodo per le determinazioni strutturate di macromolecole a risoluzione quasi atomica. Sono disponibili più pacchetti software per l'elaborazione delle immagini e i calcoli della struttura, ma il risultato sulle mappe 3D spesso varia in termini di qualità e risoluzione a causa delle differenze negli algoritmi applicati durante i calcoli. Pertanto, l'utilizzo di una combinazione di diversi programmi è spesso utile per ottenere risultati ottimali.
Questo protocollo guida gli utenti a navigare nel flusso di lavoro attraverso tre diverse piattaforme di elaborazione crio-EM: CryoSPARC, RELION e Scipion. Dimostreremo come utilizzare questa pipeline per ottenere una struttura ad alta risoluzione del virus adeno-associato che è un vettore ampiamente utilizzato per la terapia genica. Dopo aver aperto CryoSPARC v3 in un browser Web e aver creato l'area di lavoro per il progetto, passare alla nuova area di lavoro e aprire il generatore di processi nel pannello di destra.
Fare clic su Importa filmati e fornire il percorso dei filmati e ottenere il percorso del file di riferimento. Quindi impostare i parametri di acquisizione. Quindi, fai clic su coda, seleziona una corsia per eseguire il processo e un'area di lavoro e fai clic su Crea.
Aprire la correzione del movimento della patch e la scheda di lavoro importa filmati. Quindi trascinare l'output imported_movies sul segnaposto dei filmati nel nuovo processo e mettere in coda il processo. Per eseguire la funzione di trasferimento del contrasto o la stima CTF, aprire la stima CTF della patch.
Immettere le micrografie generate e mettere in coda il processo. Per ispezionare le micrografie corrette in media e CTF e selezionare un sottoinsieme per ulteriori elaborazioni, aprire le esposizioni curate, inserire le esposizioni ottenute dal passaggio precedente e mettere in coda il lavoro. Dopo che il lavoro è entrato in modalità di attesa, fare clic sulla scheda interattiva sulla scheda del lavoro.
Regolare le soglie dei parametri e accettare o rifiutare singole micrografie per un'ulteriore elaborazione. Durante l'elaborazione dei dati attuali, impostare la soglia superiore di astigmatismo a 400 angstrom, CTF adattare la risoluzione a cinque angstrom e lo spessore relativo del ghiaccio a due. Quindi fare clic su fatto per selezionare le micrografie per l'elaborazione a valle.
Per il prelievo manuale, aprire il selettore manuale. Immettere le esposizioni accettate e mettere in coda il processo. Quindi fare clic sulla scheda interattiva, impostare la dimensione della casella su 300 pixel e fare clic su alcune centinaia di particelle su più micrografie, evitando particelle sovrapposte.
Una volta terminata la selezione, fare clic su Fatto prelievo delle particelle estratte. Successivamente, per generare modelli per il prelievo automatico delle particelle, fare clic sulla classificazione 2D e inserire i prelievi di particelle generati. Quindi modificare il numero di classi 2D in 10 e mettere in coda il processo.
Quindi, apri seleziona le classi 2D e inserisci le particelle e le medie di classe ottenute nel passaggio precedente. Quindi fare clic sulla scheda interattiva, selezionare le classi 2D rappresentative con un buon rapporto segnale-rumore e fare clic su fatto. Per il prelievo di particelle basato su modelli, aprire il selettore di modelli e inserire le classi 2D e le micrografie selezionate.
Quindi impostare il diametro della particella su 220 angstrom e mettere in coda il lavoro. Infine, aprire l'estratto dalle micrografie e inserire le micrografie e le particelle ottenute dall'ispezione dei prelievi di particelle. Quindi impostare la dimensione della casella estratta su 300 pixel e accodare il processo.
Per la classificazione 2D, fare clic su Classificazione 2D e inserire le particelle estratte. Quindi impostare il numero di classi 2D su 50 e mettere in coda il processo. Quindi, apri le classi 2D selezionate e inserisci le particelle ottenute e le medie di classe.
Fare clic sulla scheda interattiva. Scegli le classi 2D in base alla risoluzione e al numero di particelle nella classe e fai clic su Fatto. Per generare un volume 3D iniziale, aprire la ricostruzione ab-initio e inserire le particelle dalla classificazione 2D finale.
Quindi regolare la simmetria a icosaedrico e mettere in coda il lavoro. Quindi, apri la raffinazione omogenea, inserisci il volume dal passaggio precedente e le particelle dalla classificazione 2D finale. Quindi modificare la simmetria e mettere in coda il processo.
Al termine del lavoro, ispezionare la correlazione della shell di Fourier o la curva FSC e scaricare il volume da esaminare in UCSF Chimera. In CryoSPARC v3, aprire la scheda di lavoro del processo di classe 2D selezionato dalla classificazione 2D finale. Quindi, nella scheda dei dettagli, fare clic su Esporta lavoro.
Utilizzando PyEM, converti il particles_exported. cs in formato stella eseguendo il comando indicato. Dopo aver fatto clic sull'estrazione delle particelle, nella scheda I/O, inserire le micrografie e le coordinate corrette CTF.
Quindi fare clic sulla scheda di estrazione, modificare la dimensione della casella delle particelle a 300 pixel ed eseguire il lavoro. Per il perfezionamento 3D, utilizzare la mappa generata in CryoSPARC v3 come modello iniziale in RELION-3. Selezionare il metodo di importazione e impostare i parametri indicati nella scheda I/O.
Quindi, nella scheda Altri, selezionare la mappa CryoSPARC v3 come file di input, modificare il tipo di nodo in riferimento 3D ed eseguire il lavoro. Quindi, selezionare il perfezionamento automatico 3D e nella scheda I / O, impostare le immagini di input come particelle. file a stella dall'ultimo processo di selezione.
Utilizzare la ricostruzione CryoSPARC v3 come mappa di riferimento, fare clic sulla scheda di riferimento e modificare il filtro passa-basso iniziale a 50 angstrom e la simmetria in icosaedrico. Quindi, nella scheda ottimizzazione, modificare il diametro della maschera in 280 angstrom ed eseguire il lavoro. Per la post-elaborazione, fare clic su post-elaborazione.
E nella scheda I / O, inserisci le mezze mappe e la maschera create e imposta la dimensione dei pixel calibrata su 1.045 angstrom. Quindi sulla scheda nitidezza, per stimare automaticamente il fattore B, immettere sì. Per la risoluzione più bassa per l'adattamento automatico B, input 10.
E per usare il tuo fattore B, inserisci no. Infine, nella scheda filtro, impostare Ignora ponderazione FSC su no ed eseguire il processo. Per l'allenamento di lucidatura, lucidatura bayesiana aperta.
E nella scheda I/O, inserisci le micrografie, le particelle e il postprocesso corretti per il movimento. file a stella ottenuto in precedenza. Fare clic sulla scheda di allenamento e impostare i parametri ottimali del treno su sì, frazione di pixel di Fourier per il test su 0,5 e utilizzare questo numero di particelle a 5.000.
Quindi eseguire il processo. Una volta terminato il lavoro di formazione, fai clic su Lucidatura bayesiana. Quindi, nella scheda allenamento, imposta i parametri ottimali del treno su no.
Selezionare la scheda di lucidatura e, nel file dei parametri ottimizzato, specificare il percorso del opt_params_all_groups. txt dal passaggio precedente e fare clic su Esegui. Per stimare le aberrazioni di ordine superiore, aprire il perfezionamento CTF.
E nella scheda I/O sotto le particelle, seleziona il percorso del file stellare contenente particelle lucide dal recente lavoro 3D raffinato. Quindi, in file STAR postprocesso, impostare il percorso dell'output dell'ultimo processo di post-elaborazione. Quindi, selezionare la scheda adatta e impostare stimare l'ingrandimento anisotropico su no.
Eseguire il fitting del parametro CTF su no. Stimare il beamtilt a sì. Stima anche il trifoglio a sì.
E stimare le aberrazioni del quarto ordine a sì. Quindi eseguire il processo. Per perfezionare e convalidare ulteriormente la mappa RELION-3, avviare Scipion 3 e creare un nuovo progetto.
Nel pannello dei protocolli di sinistra, seleziona il menu a discesa Importazioni e fai clic su Importa particelle. Modificare l'importazione dei parametri da a RELION-3 e il file star a postprocess.star. Quindi specificare i parametri di acquisizione come dimostrato in precedenza e fare clic su Esegui.
Quindi, fai clic sul menu a discesa delle importazioni e seleziona i volumi di importazione. Sotto l'importazione da, dare il percorso alla mappa RELION-3, modificare la frequenza di campionamento delle dimensioni dei pixel a 1,045 angstrom per pixel ed eseguire. Per eseguire un allineamento globale, selezionare il menu a discesa Perfeziona dal pannello protocolli e fare clic su xmipp3-highres.
Immettere le particelle e i volumi importati dai passaggi precedenti rispettivamente come immagini a grandezza naturale e volumi iniziali e impostare il gruppo di simmetria su icosaedrico. Quindi, nella scheda di allineamento dell'immagine sotto assegnazione angolare, scegli globale, imposta la risoluzione massima di destinazione su tre angstrom ed esegui il lavoro. Per eseguire un allineamento locale, selezionare xmipp3-highres global, passare da continua esecuzione precedente a sì e selezionare il processo precedente.
Quindi, nella scheda di assegnazione angolare, modificare l'allineamento dell'immagine in locale e impostare la risoluzione massima di destinazione su angstrom 2.1. Al termine, nella finestra dei risultati di xmipp3-highres, fare clic sui grafici di risoluzione dello schermo per vedere come è cambiato l'FSC dopo il perfezionamento e fare clic sull'istogramma del grafico con modifiche angolari per vedere se le assegnazioni dell'angolo di Eulero sono cambiate. Ispezionare il volume in UCSF Chimera.
Ingrandisci e cerca le funzionalità ad alta risoluzione. Le micrografie con buona vestibilità CTF e basso astigmatismo sono state selezionate per un'ulteriore elaborazione, mentre quelle con alto astigmatismo e forfait sono state scartate. Sono state selezionate medie di classe 2D contenenti classi ben definite e quelle con bassa risoluzione, rumore e particelle parziali sono state respinte.
Le regioni della mappa di microscopia crioelettronica dotate di coordinate atomiche di un virus adeno-associato sono mostrate qui. Densità EM ben definite consentono di montare catene laterali di singoli amminoacidi, molecole d'acqua e ioni di magnesio. Le curve FSC calcolate utilizzando CryoSPARC v3, RELION-3 e Scipion indicano una risoluzione crescente in tutto il flusso di lavoro, stime di risoluzione in quattro diverse sezioni attraverso le strutture e istogrammi di risoluzione dimostrano il miglioramento incrementale della risoluzione locale tra le mappe in tutto il flusso di lavoro.
La combinazione degli algoritmi di elaborazione crio-EM di CryoSPARC, RELION-3, Scipion e Phoenix ha portato a un aumento della risoluzione delle strutture virali adeno-associate da 2,9 a 2,3 angstrom attraverso la pipeline di elaborazione. È importante ricordare che i parametri specificati in ogni passaggio sono dipendenti dal campione e dal microscopio. Inoltre, la capacità di raggiungere un'alta risoluzione dipende in gran parte dalla qualità del campione e dei dati grezzi.
In questo video, presentiamo il robusto flusso di lavoro SP per l'elaborazione dei dati crio-EM su varie piattaforme software. Utilizzando questo approccio, è possibile implementare algoritmi per più programmi per perfezionare e convalidare le strutture criologiche. Questo flusso di lavoro può essere applicato ai calcoli di struttura di un'ampia varietà di assiemi macromolecolari.
