L'inclinazione dello stadio del campione fornisce un modo semplice e generalizzabile per aumentare la distribuzione di orientamento delle particelle durante la raccolta dei dati crio-EM a singola particella. La distribuzione uniforme delle particelle ottenuta grazie all'inclinazione dello stadio del campione consente di migliorare la qualità complessiva della mappa e l'interpretabilità. Iniziare allineando il microscopio per garantire un'illuminazione parallela del campione e ridurre al minimo le aberrazioni del coma.
Per identificare i quadrati adatti alla raccolta dei dati, registrare un atlante della griglia senza inclinazione dello stadio o con inclinazione del palco, che fornisce una panoramica della qualità complessiva della griglia e una prima indicazione delle aree adatte per la raccolta dei dati. Ispezionare manualmente i quadrati all'ingrandimento utilizzato nel nodo di acquisizione quadrato. Cerca i quadrati in cui la lamina è intatta, non sembra disidratata e ha uno spessore di ghiaccio ideale e sposta lo stadio del campione in un quadrato di interesse.
Determinare l'altezza eucentrica per la posizione del palco utilizzando un oscillatore alfa a circa 15 gradi di inclinazione del palcoscenico e regolare l'altezza Z per portare il palco all'altezza eucentrica utilizzando il pannello della tastiera per il microscopio. Assicurati che lo spostamento dell'immagine sia minimo durante la routine di oscillazione alfa. Per trovare un'altezza Z più accurata, stimarla nel nodo di focheggiamento all'ingrandimento utilizzato nel nodo di acquisizione quadrato.
Regolare le impostazioni per il nodo di controllo e abilitare o disabilitare l'opzione di messa a fuoco Z fine durante l'accodamento iniziale dei quadrati. Quindi premere Simulate. Inclinare lo stadio del campione all'angolo di inclinazione desiderato per la raccolta dei dati alla vera altezza eucentrica e ricentrare lo stadio se necessario.
Premere Simula nel nodo di acquisizione quadrato per iniziare a mettere in coda le destinazioni per le esposizioni dell'intero nodo di acquisizione. Quindi, selezionare un target di messa a fuoco Z e regioni con fori adatti per esposizioni ad alto ingrandimento e inviare i target alla coda per l'imaging. Riportare lo stadio del campione allo stato non inclinato e quindi passare alla casella successiva.
Ripetere questi passaggi fino a quando non è stato accodato un numero adeguato di esposizioni intere. Una volta che tutti i quadrati sono in coda, vai all'intero nodo di destinazione e premi Invia target in coda. Selezionare Consenti per la verifica da parte dell'utente dei target selezionati nelle impostazioni del nodo e ispezionare manualmente i target selezionati dal nodo di acquisizione dell'esposizione ad alto ingrandimento per verificare se il cercatore automatico di fori EM è in grado di identificare con precisione le regioni adatte per l'acquisizione dell'immagine quando lo stadio del campione è inclinato.
Una volta che l'utente è soddisfatto della precisione del targeting, deseleziona l'opzione Consenti la verifica utente delle destinazioni selezionate per la raccolta automatica dei dati. Le immagini rappresentative della griglia a ingrandimento quadrato con diversi angoli di inclinazione raccolti vicino e lontano dall'altezza Z eucentrica sono mostrate qui. Il centro del raggio è indicato dal centro degli anelli concentrici rossi e la freccia verde indica il quadrato di interesse.
C'è una caratteristica griglia interrotta adiacente al quadrato di interesse per riferimento. Di seguito sono mostrate le esposizioni rappresentative dei fori e le medie delle classi 2D raccolte con angoli di inclinazione di 0 gradi, 30 gradi e 60 gradi. Sebbene la concentrazione proteica sia invariata tra i diversi angoli di inclinazione, un angolo di inclinazione più elevato rende l'area ripresa più affollata in termini di concentrazione di particelle.
Le medie delle classi 2D interessate dal sovraffollamento sono mostrate in questo riquadro rosso. La semplicità del protocollo consente a qualsiasi utente standard del microscopio di adattare facilmente una strategia di raccolta dati inclinata.
