Questo protocollo delinea la preparazione di lamelle vitreali di globuli rossi infetti da Plasmodium-falciparum per la tomografia crioelettronica. Ciò consente l'osservazione diretta di informazioni strutturali dettagliate su come il parassita causa la malaria. La tomografia crioelettronica registra informazioni ad alta risoluzione sull'interno delle cellule.
È abbastanza potente da osservare singoli complessi proteici in situ, che possono essere estratti computazionalmente e mediati per rivelare informazioni strutturali tridimensionali sulle proteine. Questo protocollo può essere facilmente adattato a diversi tipi di cellule e può essere un punto di partenza per chi è nuovo alla produzione di lamelle vitreali per la tomografia crioelettronica. Questa è Alejandra Carbajal, che oggi eseguirà il protocollo.
Per iniziare, schermare le griglie di rame congelate utilizzando un CryoStage per un microscopio ottico con particolare attenzione al gradiente di ghiaccio attraverso la griglia. Controllare i singoli quadrati della griglia per la copertura delle celle nelle aree più sottili del ghiaccio. Utilizzare un pennarello nero indelebile per contrassegnare la parte anteriore e il lato opposto dei cerchi Autogrid specifici per Cryo-FIB-SEM.
Caricare la griglia ritagliata nella navetta Cryo-FIB-SEM con il lato in carbonio rivolto verso l'alto e applicare uno strato rotante in carbonio o platino di quattro nanometri di spessore sulla superficie delle celle. Caricare la navetta nel Cryo-FIB-SEM e valutare la distribuzione delle celle su ciascuna rete tramite SEM a cinque kilovolt. Prendi una panoramica a basso ingrandimento a 100 potenza per osservare i gradienti di ghiaccio attraverso la griglia.
Quindi scatta immagini con ingrandimenti più elevati a 5.000 potenza per guardare i singoli quadrati della griglia. Applicare uno strato di organoplatino a due micrometri sulla superficie di ciascuna griglia inserendo l'ago del sistema di iniezione di gas nella camera sopra la griglia e riscaldando la sorgente di organoplatino a una temperatura impostata per un tempo impostato per produrre un flusso di vapore. Per osservare il campione, inclinare il campione in modo che il piano della griglia sia di circa 10 gradi dall'angolo di incidenza del fascio ionico e spostare il centro di un quadrato della griglia adatto per essere visto sia nelle immagini SEM che FIB.
utilizzando il fascio di ioni a bassa corrente, Osserva la griglia ad un alto ingrandimento per visualizzare le celle al centro di un quadrato della griglia. Segna due modelli rettangolari da fresare, uno sopra e uno sotto una regione protetta spessa tre micrometri. Quindi scegli le impostazioni del fascio e correggi l'astigmatismo regolando la luminosità e il contrasto.
al termine della configurazione, avviare la fresatura a una corrente di 300 picoampere monitorando l'avanzamento in tempo reale nella vista del fascio ionico e in modo intermittente tramite SEM. Il campione viene controllato nella vista SEM e dopo la prima fresatura, Se il fascio ionico non ha sfondato il campione sopra e sotto la regione protetta, rimuovere altro materiale aumentando l'altezza dei motivi rettangolari. Interrompere la fresatura quando la superficie sopra e sotto la lamella è completamente liscia nella vista del fascio ionico.
Ripetere il processo di fresatura gradualmente, riducendo ogni volta la corrente del fascio ionico fino a raggiungere uno spessore di 300 nanometri. Registra la posizione X Y Z di ciascuna lamella. Per lucidare le lamelle alla fine dell'esperimento, utilizzare una panoramica SEM a basso ingrandimento per selezionare un gruppo di lamelle da lucidare e contrassegnare la radice di lucidatura.
Una volta marcata la radice di lucidatura, ridurre lo spazio tra i due modelli rettangolari a 100-200 nanometri e iniziare la lucidatura a una corrente di fascio ionico di 30 picoamperes. Monitorate l'avanzamento tramite SEM a due o tre kilovolt. Interrompere la lucidatura quando il contrasto nella lamella viene perso dalla SEM o quando il rivestimento organoplatino o la lamella stessa iniziano a perdere integrità.
Acquisisci e salva immagini SEM a basso ingrandimento di ciascuna lamella. Dopo il completamento dell'esperimento, rimuovere la navetta dal microscopio. Rimuovere le griglie con lamelle e conservarle sotto azoto liquido.
Maneggiare le griglie con cura. Per studiare la morfologia, gli schizonti sono stati bloccati in diversi stadi di uscita usando il composto due negli inibitori E-64. In presenza del composto due, il confine tra le membrane parassitofore e l'emoglobina circostante nel globulo rosso ospite era ben definito.
Il vacuolo parassitoforo intatto, o PV, era pieno di merozoiti in un singolo gruppo di cristalli di emozoino. Quando due schizonti sincronizzati composti sono stati lavati in E-64, la membrana PV è stata rotta e i merozoiti si sono diffusi all'interno del RBC. Un tipico esempio di buona distribuzione cellulare su una griglia di rame mostra grandi globuli rossi con una periferia ben definita e una membrana vacuola intatta.
All'interno di un globulo rosso ospite parzialmente collassato, i singoli merozoiti sono stati visualizzati come piccoli gruppi di cellule. Ogni schizonte aveva una macchia nera al centro che indicava la posizione dei cristalli di emozoina. Dopo la fresatura, le griglie sono state caricate nel TEM per identificare le posizioni delle lamelle e trovare aree adatte da colpire mediante tomografia.
Nella micrografia del campione, si può vedere un RBC che era stato recentemente invaso da un merozoite. La merozoite circondata dalla membrana derivata dalla cellula ospite potrebbe essere vista all'interno del confine dei globuli rossi. All'estremità apicale del merozoite, le due membrane che circondano la cellula e quattro membrane impilate all'apice del merozoite associate a una caratteristica a forma di fungo densa di elettroni erano chiaramente visibili.
All'interno del citoplasma del merozoite, è stato identificato un evento di fusione tra la membrana plasmatica della merozoite e una vescicola multistrato. In un'ulteriore analisi TEM di una lamella spessa 230 nanometri, è stata osservata la morfologia tipica di un merozoite maturo trattato con E-64. All'interno della membrana dei globuli rossi, la membrana plasmatica dei merozoiti può essere vista con organelli come il complesso della membrana interna, gli anelli polari, i micronemi, i rhoptries e l'involucro nucleare.
La parte più importante di questa tecnica è l'ottimizzazione delle griglie per consentire una produzione riproducibile ed efficiente di lamelle sottili. L'ulteriore sviluppo di questa tecnica consentirà ai ricercatori di visualizzare molecole monoproteiche all'interno dei parassiti malarici e determinare il loro ruolo nell'uscita della malaria.
