Le cellule staminali mesenchimali derivate da cuscinetti di grasso infrarotuleo, o in breve, IFP-MSC, sono un tipo di cellule staminali relativamente meno studiato. Questo protocollo è un metodo semplice, affidabile e riproducibile che dimostra l'isolamento delle IFP-MSC dall'articolazione di soffocamento della capra. Il vantaggio principale della tecnica è che è possibile ottenere un gran numero di IFP-MSC di alta qualità.
Le IFP-MSC isolate possono differenziarsi in più linee e possedere un ampio potenziale rigenerativo. Grazie alla loro posizione anatomica, le IFP-MSC hanno acquisito interesse nella riparazione dei difetti della cartilagine e nell'alleviare la degradazione della cartilagine nell'osteoartrite. Il metodo ha implicazioni per la terapia cellulare nel campo dell'ingegneria tissutale e della medicina rigenerativa.
La procedura per l'isolamento, l'espansione e la differenziazione delle IFP-MSC sarà dimostrata dal Dr.Sugata Hazra e dal Sig. Aman Mahajan. Per iniziare l'isolamento delle cellule staminali mesenchimali infrapatulee, o IFP-MSC, raccogliere le articolazioni femorotibiali di capra che comprendono circa 15 centimetri delle regioni femorali e tibiali degli arti posteriori in una scatola di campioni di raccolta sterilizzata. Conservare il campione a quattro gradi Celsius per il trasporto in laboratorio per ulteriori elaborazioni.
Posizionare il campione su una piastra di Petri da 150 millimetri e assicurarsi di elaborare il campione in modo asettico e su un armadio di biosicurezza durante tutta la procedura. Risciacquare abbondantemente con PBS autoclavato integrato con antibiotici. Mantenere il campione idratato utilizzando PBS.
Esaminare attentamente le regioni anatomiche del campione. Per un facile accesso, rimuovere completamente i tessuti extra da entrambe le ossa lunghe tenendo la superficie terminale dell'osso del femore con una mano e tagliandola longitudinalmente verso l'articolazione usando forbici affilate. Quindi, senza disturbare il tessuto che circonda la capsula articolare, rimuovere i muscoli e il tessuto adiposo dall'osso.
Allo stesso modo, fare un'altra incisione all'estremità tibiale del campione e rimuovere i muscoli e il tessuto adiposo dall'osso tibiale. Assicurarsi che entrambe le ossa lunghe siano completamente esposte e che la capsula articolare sia visibile. Quindi, praticare un'incisione da entrambi i lati della membrana sinoviale per tagliare l'articolazione articolare.
Tagliare la rotula dalla membrana sinoviale e dai legamenti rotulei usando forbici e pinze sterilizzate fresche. Posizionare immediatamente la rotula separata in una capsula di Petri contenente PBS. Dalla rotula separata, rimuovere l'intero cuscinetto adiposo presente sulla superficie interna usando forbici e pinze.
Raccoglietelo in un'altra capsula di Petri fresca e tritatelo usando un bisturi. Includere altri strumenti chirurgici per ottenere i piccoli segmenti di grasso di circa due o tre millimetri. Utilizzare una spatola per trasferire il tessuto tritato in una provetta da centrifuga da 50 millilitri e lavarlo tre volte con PBS integrato con antibiotici per 15 minuti a temperatura ambiente utilizzando un miscelatore per provetta.
Per la digestione enzimatica, incubare circa cinque grammi di tessuto tritato in Modified Eagle Media di Dulbecco, o DMEM, mezzi a basso contenuto di glucosio contenenti 1,5 milligrammi per millilitro di collagenasi di tipo II e 2% FBS a 37 gradi Celsius per 12-16 ore. Aspirare con cura il tessuto digerito e filtrarlo attraverso un filtro cellulare da 70 micron per rimuovere qualsiasi parte non digerita. Centrifugare il filtrato in una provetta da 15 millilitri a 150 volte g per cinque minuti.
Rimuovere il surnatante prima di lavare il pellet cellulare con DMEM a basso contenuto di glucosio due volte. Risospendere il pellet in DMEM completo, noto anche come mezzo di espansione. Seminare le cellule su una piastra di Petri da 150 millimetri e coltivarle nel mezzo di espansione integrato con cinque nanogrammi per millilitro di fattore di crescita dei fibroblasti di base, o BFGF, e 50 microgrammi per millilitro di sale trisodico dell'acido 2-fosfo-L-ascorbico.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al 5% per consentire alle cellule di aderire e proliferare. Monitorare l'attaccamento e la crescita delle cellule ogni giorno. Per una corretta manutenzione ed espansione delle IFP-MSC, cambiare il supporto ogni tre giorni.
Durante la sostituzione del supporto, aggiungere cinque nanogrammi freschi per millilitro di BFGF e 50 microgrammi per millimetro di sale trisodico dell'acido 2-fosfo-L-ascorbico direttamente nella capsula di Petri. Una volta che le cellule diventano confluenti dall'80% al 90%, sottocoltivarle rimuovendo il mezzo di espansione dalla piastra di Petri e lavando le cellule con 1X PBS. Quindi aggiungere quattro millilitri di 0,25% Tripsina-EDTA al piatto e incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al 5%.
Dopo quattro minuti, picchiettare la piastra su un lato per rimuovere le celle. Confermare il completo distacco di tutte le cellule al microscopio. Una volta confermato, aggiungere un volume uguale di mezzi di espansione per neutralizzare la tripsina.
Utilizzare una pipetta per raccogliere queste cellule dissociate in un tubo di polipropilene fresco da 15 millilitri e centrifugarle a 150 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospendere il pellet nel volume desiderato di mezzi di espansione. Contare le cellule utilizzando il metodo standard di conteggio delle cellule e sottocoltivarle per un'ulteriore espansione a una densità di semina di 10.000 cellule per centimetro quadrato in una capsula di Petri da 150 millilitri.
Per tutti i test, utilizzare un monostrato confluente di celle di passaggio da P2 a P5. Quando le cellule espanse raggiungono l'80% al 90% di confluenza, dissociare le cellule usando la soluzione di tripsina-EDTA prima di pellettarle in una provetta da centrifuga da 15 millilitri a 150 volte g per cinque minuti. Quindi risospendere il pellet nel plasma di capra ad una densità di 2 milioni di cellule per 50 microlitri. Aggiungere 50 microlitri di plasma contenente le cellule su una capsula di Petri sterilizzata da 90 millimetri, seguita dall'aggiunta di cloruro di calcio ad una concentrazione finale dello 0,3% Mescolare bene per fabbricare idrogel plasmatico reticolato.
Dopo aver incubato l'idrogel fabbricato a 37 gradi Celsius per 40 minuti, trasferire gli idrogel in piastre di coltura tissutale a 24 pozzetti contenenti mezzi condrogeni. Cambiare il supporto ogni tre giorni per 14 giorni. Gli idrogel coltivati in mezzi DMEM completi senza TGF-beta 1 sono considerati controlli non indotti.
Dopo 14 giorni di differenziazione condrogena delle cellule in idrogel plasmatico, lavare gli idrogel tre volte con PBS per cinque minuti ciascuno e fissare i campioni in formalina tamponata neutra per tre ore. Le IFP-MSC isolate erano omogeneicamente aderenti e hanno raggiunto una morfologia allungata entro 24 ore dalla coltura in vitro. Le cellule hanno proliferato in modo efficiente dall'80% al 90% di confluenza entro sei giorni dall'espansione e hanno mostrato capacità clonogeniche, indicando efficienti capacità proliferative e di auto-rinnovamento.
Quando trattate per differenziarsi in lenza adipogenica, le cellule isolate hanno prodotto goccioline lipidiche, che è stata confermata dalla colorazione Oil Red O nei giorni 14 e 21. Tali goccioline di olio non erano visibili nelle cellule senza fattori induttori adipogeni. Le cellule isolate incapsulate in idrogel plasmatico hanno mostrato la formazione di neo-tessuto bianco e lucido dopo 14 giorni nel gruppo indotto ha mostrato il potenziale condrogenico.
Il gruppo non indotto aveva tessuto bianco pallido con ridotta lucentezza. Inoltre, la colorazione istologica positiva per Alcian Blue e Safranin O nel gruppo indotto ha indicato che le cellule potrebbero secernere glicosaminoglicani solfatati, uno dei componenti principali della matrice cartilaginea. Al contrario, le sezioni di idrogel dei gruppi non indotti erano negative per la colorazione con Safranina O e Alcian Blue, confermando il potenziale di differenziazione condrogena delle cellule staminali mesenchimali solo in presenza di stimoli condrogeni.
Le cellule isolate indotte con mezzi osteogenici hanno mostrato colorazione positiva per fosfatasi alcalina, confermando la mineralizzazione alla fine di 14 giorni. Dopo 28 giorni di induzione osteogenica, le deposizioni calcificate sono state osservate con colorazione Alizarin Red S. I risultati hanno sottolineato il potenziale di differenziazione delle cellule indotte in linee adipogeniche, condrogeniche e osteogeniche.
È essenziale trattare il campione in condizioni asettiche per evitare la contaminazione. È anche importante identificare la posizione corretta della rotula. Questa procedura apre la strada per isolare vari tipi di cellule, come condrociti articolari, fibroblasti legamentosi e cellule staminali da sinovia e liquido sinoviale, con ampie applicazioni nella medicina rigenerativa.
Dopo l'isolamento delle IFP-MSC utilizzando questa tecnica, la sua efficacia è stata studiata in particolare per la rigenerazione dei tessuti muscoloscheletrici, come cartilagine, osso e legamento, utilizzando approcci senza impalcature e impalcature.
