Gli autori desiderano ringraziare Xixia Luo per un&#39;eccellente allevamento di pesci e di supporto tecnico. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health sovvenzioni R21EY019401 (RT) e P30EY04068 (RT), e fondi di start-up a RT, tra cui una sovvenzione illimitata di ricerca per prevenire la cecità alla Wayne State University, Dipartimento di Oftalmologia. JT è stato sostenuto da un Thomas C. Rumble Fellowship fornito dalla Wayne State University Graduate School.

Tutte le procedure descritte in questo protocollo è stato approvato dal comitato di utilizzo degli animali presso la Wayne State University School of Medicine. 1. Adattamento al buio <ol><li> Trasferimento ~ 10 pesci adulti albino o pigmentato dal sistema abitativo normale in un involucro scuro. Se disponibile, utilizzare un involucro scuro che è incorporata nel modulo alloggiamento zebrafish, che consente il flusso dell&#39;acqua normale attraverso il serbatoio. (Se un tale sistema non sia disponibile, posizionare il serbatoio di pesce in un involucro completamente buio, avendo cura di aerare il pesce con l&#39;ossigeno). </li><li> Conservare il pesce al buio per 10 giorni. Quando l&#39;alimentazione degli animali o l&#39;aggiunta di nuovi pesci alla casella buio, assicurarsi di muoversi il più rapidamente possibile per evitare di esporre il pesce ad un lungo periodo di luce. </li></ol> 2. L&#39;esposizione ai raggi UV della luce <ol><li> Assicurarsi che l&#39;alimentazione alla sorgente di raggi UV è OFF. Rimuovere il filamento della luce UV da stereomicroscopio a fluorescenza. <ol><li> Utilizzare un inverted15 cm di diametro in vetro Petri (o qualcosa di simile due centimetri altezza) come supporto per il filamento UV. Tape la capsula di Petri di banco di laboratorio. </li><li> Nastro il filamento luce UV alla parte superiore del piatto rovesciato Petri. Disporre modo che ~ 2 mm fine degli aggetti filamento capsula di Petri. </li></ol></li><li> Ottenere un bicchiere di vetro da 250 ml. Coprire ½ del fondo, laterale e posteriore del becher con foglio di alluminio, assicurandosi che il lato &quot;splendente&quot; della lamina affronta l&#39;interno del bicchiere. Se il bicchiere è graduato, coprire la metà formulazione del bicchiere con un foglio, lasciando la chiara metà del bicchiere esposto. </li><li> Riempire il becher da 250 ml con 100 ml di acqua dal sistema di impianto pesce. </li><li> Porre il bicchiere da 250 ml in un bicchiere 4 L. Riempire il bicchiere 4 L con acqua finché il livello dell&#39;acqua è anche con la linea 100 ml di acqua nel becher da 250 ml. </li><li> Aggiungere un massimo di 10 animali scuro trattati al bicchiere da 250 ml. Coprire il bicchiere da 250 ml, con un piccolo pezzo di alluminiosventare. </li><li> Posizionare l&#39;intero apparato becher immediatamente adiacente al filamento UV. Il filamento deve toccare la parte esterna del bicchiere 4 L e rivolta verso la porzione esposta del becher da 250 ml. Assicurarsi che il bicchiere da 250 ml è centrata nel fondo del becher 4 L. </li><li> Posizionare un grande schermo opaco dietro il becher 4L, consentendo gli animali siano esposti, ma impedendo qualsiasi personale di laboratorio di vedere la punta del filamento UV. ATTENZIONE: assicurarsi che questa barriera è a posto prima di accendere l&#39;alimentazione alla sorgente di raggi UV. </li><li> Accendere la fonte di energia UV. Imposta il timer per 30 min. Luogo con qualsiasi etichette di avvertimento necessarie per garantire che il personale di laboratorio ignari non si espongono accidentalmente a radiazioni UV. </li><li> Dopo 30 minuti, spegnere la fonte di energia UV. Rimuovere il becher da 250 ml con il pesce. NOTA: se sono necessari più cicli di esposizione ai raggi UV, lasciare che la fonte di alimentazione raffreddare (~ 20 min) prima di ripetere il protocollo di esposizione. Assicurarsi di sostituire tha 100 ml di acqua con acqua fresca sistema per ogni esposizione. L&#39;acqua nel becher 4 L non necessita di essere sostituito. </li></ol> 3. Lampada alogena Luce Esposizione <ol><li> Trasferire il pesce da 250 ml in un bicchiere L acrilico serbatoio di pesci 1.8. Riempire il serbatoio fino al segno di overflow. </li><li> Posizionare la lampada zona da trattare luce alogena. Ottenere quattro 250 W Lampade alogene utilità da un negozio di ferramenta locale. Di fronte a due lampade nella stessa direzione, organizzare 29 centimetri a parte sul centro. Disporre le altre due lampade in modo simile. <ol><li> Posizionare la seconda serie di lampade in modo che essi sono di fronte alla prima serie di lampade, lasciando ~ 73 cm tra gli insiemi di due lampade. Questo crea una zona di trattamento luce a forma di rettangolo di 29 x 73 cm. </li></ol></li><li> Ottenere un piccolo ventilatore da un negozio di ferramenta locale. Posizionare la ventola equidistante tra le due serie di lampade, appena al di fuori della zona di trattamento luce. </li><li> Posizionare due 1.8 L serbatoi pieni di acqua nel centro delzona di trattamento luce, equidistante tra le due serie di lampade. La distanza tra le lampade e la parete esterna del serbatoio dovrebbe essere ~ 29 cm. Nota: anche se solo trattamento 10 pesci in un serbatoio di 1,8 L, utilizzare questo accordo. Sono necessari entrambi i serbatoi per mantenere la temperatura dell&#39;acqua di ciascun serbatoio all&#39;interno della gamma appropriata. </li><li> Inserire un aeratore ossigeno in ogni serbatoio. </li><li> Coprire ogni serbatoio con chiare coperchi acrilici, lasciando un ~ 2 centimetri vuoto a fine vicina alla ventola. Disporre la ventola in modo che possa soffiare aria in questa lacuna. Posizionare un termometro in uno o entrambi i serbatoi. </li><li> Attivare l&#39;alimentazione per le luci, ventole e aeratori. Mantenere il trattamento della luce per un massimo di 4 giorni. Il pesce non deve essere alimentato durante il trattamento con la luce, per non compromettere la qualità dell&#39;acqua e provocare più stress agli animali. </li><li> Monitorare il livello di temperatura e di acqua su una base quotidiana. Mantenere la temperatura a 30-33 ° C. Se necessario, regolare la velocità della ventola e / o la distanza tra i serbatoi e il lights. <ol><li> Top fuori ogni serbatoio con acqua sistema, se necessario, di solito tutti i giorni. </li><li> Usare sempre sano zebrafish adulto (tipicamente 6-9 mesi di età) a mantenere un tasso di sopravvivenza di quasi il 100%. Tuttavia, se un pesce viene trovato morto nel serbatoio, rimuoverla immediatamente e sostituire l&#39;acqua nel serbatoio intero. </li></ol></li></ol> 4. Collezione tessuti <ol><li> 48 ore dopo l&#39;inizio del trattamento con luce alogena togliere il pesce dalla zona da trattare. <ol><li> Preparare fresco fissativo formaldeide etanolica (1 parte di formaldeide al 37%, 9 parti di 100% di etanolo). </li><li> Euthanize zebrafish con una dose eccessiva di anestetico 2-fenossietanolo (0,4 mg / L). </li><li> Trasferire il pesce zebra eutanasia di un tovagliolo di carta. Enucleare l&#39;occhio usando pinze curve. </li><li> Mettere gli occhi enucleati in fissativo e negozio O / N a 4 ° C. </li></ol></li><li> Cryoprotect gli occhi. <ol><li> Lavare gli occhi in 5% di saccarosio 1x PBS per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi sostituire confresco 5% di saccarosio 1x PBS per 2 h. Successivamente, lavare gli occhi nel 30% saccarosio PBS 1x O / N a 4 ° C. Lavare gli occhi in un 01:01 (parti uguali) del tessuto congelamento medie e il 30% di saccarosio 1x PBS O / N a 4 ° C. </li></ol></li><li> Incorpora gli occhi in 100% tessuto congelamento medio e conservare a -80 ° C. Orientare gli occhi in modo che criosezionamento del tessuto viene eseguita sul asse dorsale / ventrale. </li><li> Cryosection il tessuto e posto su vetrini. Diapositive caldi per 2 ore a 55 ° C. Conservare i vetrini a -80 ° C o eseguire immediatamente immunoistochimica standard. </li><li> Eseguire immunoistochimica standard su tessuto sezionato e immagine con la microscopia a fluorescenza 40,51. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui mostriamo che la combinazione di una breve esposizione ai raggi UV, con un continuo brillante luce i risultati di esposizione nella perdita dei fotorecettori capillare e una risposta rigenerazione robusto. Rispetto ai singoli metodi LIRD, questo metodo combinato è anche il protocollo più efficace per danneggiare entrambe le aste e coni in entrambe le metà della retina. È importante sottolineare che questo trattamento è efficace in animali pigmentati così come gli animali albini. <p class="jove_con...

Indotto dalla luce degenerazione retinica (LIRD) è comunemente usato in entrambi i roditori e zebrafish per asta danni e fotorecettori cono. In zebrafish adulto, la degenerazione dei fotorecettori innesca Müller cellule gliali di rientrare nel ciclo cellulare e produrre progenitori transitoria-amplificazione. Questi progenitori continuano a proliferare quando migrano alla zona danneggiata, dove in ultima analisi, danno luogo a nuovi fotorecettori. Attualmente esistono due paradigmi LIRD ampiamente usate, ognuna delle quali provoca vari gradi di perdita dei fotorecettori e corrispondenti differenze nella risposta rigenerazione. Come strumenti più genetici e farmacologici sono disponibili per testare il ruolo dei singoli geni di interesse durante la rigenerazione, vi è la necessità di sviluppare un paradigma LIRD robusto. Qui si descrive un protocollo LIRD che si traduce in perdita diffusa e costante di entrambe bastoncelli e coni in cui abbiamo combinato l&#39;uso di due tecniche LIRD stabiliti in precedenza. Inoltre, Questo protocollo può essere esteso ad animali pigmentati, che elimina la necessità di mantenere le linee transgeniche di interesse sullo sfondo albino per gli studi LIRD.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="586">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV light source</td>
			<td style="width:215px;">Leica</td>
			<td style="width:155px;">EL600</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Petri dish (150 x 20 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td>
			<td>CLS3160152BO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 ml glass beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td>
			<td>CLS1000250</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4 L glass beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td>
			<td>CLS10004L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminum foil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>01-213-105</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 W halogen lamps</td>
			<td>Workforce</td>
			<td>265-669</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.8 L clear acrylic tanks</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZT180T</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.8 L clear acrylic tank lids</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZT180LCL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fan</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>HT-900</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aerator</td>
			<td>Tetra</td>
			<td>77853-900</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermometer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>YO-08008-58</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bent forceps (5/45)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504155</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish

Indotto dalla luce degenerazione retinica (LIRD) è comunemente usato in entrambi i roditori e zebrafish per asta danni e fotorecettori cono. In zebrafish adulto, la degenerazione dei fotorecettori innesca Müller cellule gliali di rientrare nel ciclo cellulare e produrre progenitori transitoria-amplificazione. Questi progenitori continuano a proliferare quando migrano alla zona danneggiata, dove in ultima analisi, danno luogo a nuovi fotorecettori. Attualmente esistono due paradigmi LIRD ampiamente usate, ognuna delle quali provoca vari gradi di perdita dei fotorecettori e corrispondenti differenze nella risposta rigenerazione. Come strumenti più genetici e farmacologici sono disponibili per testare il ruolo dei singoli geni di interesse durante la rigenerazione, vi è la necessità di sviluppare un paradigma LIRD robusto. Qui si descrive un protocollo LIRD che si traduce in perdita diffusa e costante di entrambe bastoncelli e coni in cui abbiamo combinato l&#39;uso di due tecniche LIRD stabiliti in precedenza. Inoltre, Questo protocollo può essere esteso ad animali pigmentati, che elimina la necessità di mantenere le linee transgeniche di interesse sullo sfondo albino per gli studi LIRD.

Il protocollo di trattamento finora descritto luce è stata confrontata con ogni singolo metodo di LIRD. Nel buio trattati con animali adulti albini (Figure 3-5), i singoli trattamenti di luce determinato una notevole perdita di canna (figura 3) e il cono (Figura 4) fotorecettori. Tuttavia, entrambi i trattamenti individuali principalmente danneggiati fotorecettori nella metà dorsale della retina, lasciando la retina ventrale relativamente protetto dai trattam...

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A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

Protocolli multipli danni leggeri sono stati descritti da fotorecettori danni e di conseguenza indurre una risposta rigenerazione della retina in zebrafish adulto. Questo protocollo descrive un metodo migliorato che può essere utilizzato in animali pigmentate e che danneggia la stragrande maggioranza di canna e cono fotorecettori attraverso l&#39;intera retina.

A Novel Luce Danni Paradigma per l&#39;uso in retina Rigenerazione Studi in Zebrafish adulti

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.1K Views.  Wayne State University School of Medicine.  Protocolli multipli danni leggeri sono stati descritti da fotorecettori danni e di conseguenza indurre una risposta rigenerazione della retina in zebrafish adulto. Questo protocollo descrive un metodo migliorato che può essere utilizzato in animali pigmentate e che danneggia la stragrande maggioranza di canna e cono fotorecettori attraverso l'intera retina. 

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Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, including rats, hamsters, and mice, are active during the night and relatively inactive during the day. Many other behavioral and physiological measures also exhibit daily rhythms, but in rodents, running-wheel activity serves as a particularly reliable and convenient measure of the output of the master circadian clock, the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus. In general, through a process called entrainment, the daily pattern of running-wheel activity will naturally align with the environmental light-dark cycle (LD cycle; e.g. 12 hr-light:12 hr-dark). However circadian rhythms are endogenously generated patterns in behavior that exhibit a ~24 hr period, and persist in constant darkness. Thus, in the absence of an LD cycle, the recording and analysis of running-wheel activity can be used to determine the subjective time-of-day. Because these rhythms are directed by the circadian clock the subjective time-of-day is referred to as the circadian time (CT). In contrast, when an LD cycle is present, the time-of-day that is determined by the environmental LD cycle is called the zeitgeber time (ZT).
Although circadian rhythms in running-wheel activity are typically linked to the SCN clock6-8, circadian oscillators in many other regions of the brain and body9-14 could also be involved in the regulation of daily activity rhythms. For instance, daily rhythms in food-anticipatory activity do not require the SCN15,16 and instead, are correlated with changes in the activity of extra-SCN oscillators17-20. Thus, running-wheel activity recordings can provide important behavioral information not only about the output of the master SCN clock, but also on the activity of extra-SCN oscillators. Below we describe the equipment and methods used to record, analyze and display circadian locomotor activity rhythms in laboratory rodents.

Circadian rhythms in voluntary wheel-running activity in mammals are tightly coupled to the molecular oscillations of a master clock in the brain. As such, these daily rhythms in behavior can be used to study the influence of genetic, pharmacological, and environmental factors on the functioning of this circadian clock.

Registrazione e analisi dei ritmi circadiani in Running-ruota Attività nei roditori

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Ricerca

Neuroscienze

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Etichettatura retrograda di cellule gangliari della retina in Zebrafish adulti con coloranti fluorescenti

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular mechanisms involved in zebrafish adult central nervous system (CNS) regeneration and repair, we developed a zebrafish model of adult telencephalic injury.
In this approach, we manually generate an injury by pushing an insulin syringe needle into the zebrafish adult telencephalon. At different post injury days, fish are sacrificed, their brains are dissected out and stained by immunohistochemistry and/or in situ hybridization (ISH) with appropriate markers to observe cell proliferation, gliogenesis, and neurogenesis. The contralateral unlesioned hemisphere serves as an internal control. This method combined for example with RNA deep sequencing can help to screen for new genes with a role in zebrafish adult telencephalon neurogenesis, regeneration, and repair.

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Stab Ferita Lesione del Zebrafish adulti Telencefalo: Un metodo per Indagare vertebrati cervello neurogenesi e rigenerazione

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain undergoes rapid organizational change and is similar to accelerated brain changes that occur during the third trimester in humans. This model of fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produces severe brain damage, mimicking the amount and pattern of binge-drinking that occurs in some pregnant alcoholic mothers. We describe the use of trace eyeblink classical conditioning (ECC), a higher-order variant of associative learning, to assess long-term hippocampal dysfunction that is typically seen in alcohol-exposed adult offspring. At 90 days of age, rodents were surgically prepared with recording and stimulating electrodes, which measured electromyographic (EMG) blink activity from the left eyelid muscle and delivered mild shock posterior to the left eye, respectively. After a 5 day recovery period, they underwent 6 sessions of trace ECC to determine associative learning differences between alcohol-exposed and control rats. Trace ECC is one of many possible ECC procedures that can be easily modified using the same equipment and software, so that different neural systems can be assessed. ECC procedures in general, can be used as diagnostic tools for detecting neural pathology in different brain systems and different conditions that insult the brain.

Trace eyeblink classical conditioning (ECC) was used to assess hippocampal-dependent associative learning in adult rats that were administered a high concentration (11.9% v/v) of alcohol during early neonatal brain development. In general, ECC procedures are sound diagnostic tools for detecting brain dysfunction across many psychological and biomedical settings.

L'uso di traccia Eyeblink condizionamento classico per valutare la disfunzione Hippocampal in un modello del ratto dei disturbi dello spettro fetale alcol

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

Modeling Amyloid-&amp;#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

Modellazione dell'amiloide-β42 tossicità e neurodegenerazione nel cervello adulto di Zebrafish

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after severe damage. Investigating the regeneration pathways in zebrafish might bring new insights to develop innovative strategies for the treatment of retinal degenerative diseases in mammals. Herein, we focused on the induction of a focal lesion to the outer retina in adult zebrafish by means of a 532 nm diode laser. A localized injury allows investigating biological processes that take place during retinal degeneration and regeneration directly at the area of damage. Using non-invasive optical coherence tomography (OCT), we were able to define the location of the damaged area and monitor subsequent regeneration in vivo. Indeed, OCT imaging produces high-resolution, cross-sectional images of the zebrafish retina, providing information which was previously only available with histological analyses. In order to confirm the data from real-time OCT, histological sections were performed and regenerative response after the induction of the retinal injury was investigated by immunohistochemistry.

M&amp;#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

The zebrafish is a popular animal model to study mechanisms of retinal degeneration/regeneration in vertebrates. This protocol describes a method to induce localized injury disrupting the outer retina with minimal damage to the inner retina. Subsequently, we monitor in vivo the retinal morphology and the M&#252;ller glia response throughout retinal regeneration.

Attivazione delle cellule di Glia di Müller in una degenerazione retinica indotta da Laser e un modello di rigenerazione in Zebrafish

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding diseases, and future therapies hinge on fundamental understandings about how different retinal cells function normally. Gaining such information with biochemical methods has proven difficult because contributions of particular cell types are diminished in the retinal cell milieu. Live retinal imaging can provide a view of numerous biological processes on a subcellular level, thanks to a growing number of genetically encoded fluorescent biosensors. However, this technique has thus far been limited to tadpoles and zebrafish larvae, the outermost retinal layers of isolated retinas, or lower resolution imaging of retinas in live animals. Here we present a method for generating live ex vivo retinal slices from adult zebrafish for live imaging via confocal microscopy. This preparation yields transverse slices with all retinal layers and most cell types visible for performing confocal imaging experiments using perfusion. Transgenic zebrafish expressing fluorescent proteins or biosensors in specific retinal cell types or organelles are used to extract single-cell information from an intact retina. Additionally, retinal slices can be loaded with fluorescent indicator dyes, adding to the method&#39;s versatility. This protocol was developed for imaging Ca2+ within zebrafish cone photoreceptors, but with proper markers it could be adapted to measure Ca2+ or metabolites in M&#252;ller cells, bipolar and horizontal cells, microglia, amacrine cells, or retinal ganglion cells. The retinal pigment epithelium is removed from slices so this method is not suitable for studying that cell type. With practice, it is possible to generate serial slices from one animal for multiple experiments. This adaptable technique provides a powerful tool for answering many questions about retinal cell biology, Ca2+, and energy homeostasis.

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Imaging retinal tissue can provide single-cell information that cannot be gathered from traditional biochemical methods. This protocol describes preparation of retinal slices from zebrafish for confocal imaging. Fluorescent genetically encoded sensors or indicator dyes allow visualization of numerous biological processes in distinct retinal cell types.

Preparazione fette fresche della retina dallo Zebrafish adulto per Ex Vivo Imaging esperimenti

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

Ablazione di una popolazione neuronale utilizzando un Laser del due-fotone e sua valutazione usando formazione immagine del calcio e registrazione del comportamento nelle larve di Zebrafish

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the detonation of explosive devices, however, the mechanisms that underlie the brain damage resulting from blast overpressure exposure are not entirely understood and are believed to be unique to this type of brain injury. Preclinical models are crucial tools that contribute to better understand blast-induced brain injury. A novel in vitro blast TBI model was developed using an open-ended shock tube to simulate real-life open-field blast waves modelled by the Friedlander waveform. C57BL/6N mouse organotypic hippocampal slice cultures were exposed to single shock waves and the development of injury was characterized up to 72 h using propidium iodide, a well-established fluorescent marker of cell damage that only penetrates cells with compromised cellular membranes. Propidium iodide fluorescence was significantly higher in the slices exposed to a blast wave when compared with sham slices throughout the duration of the protocol. The brain tissue injury is very reproducible and proportional to the peak overpressure of the shock wave applied.

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

This paper describes a novel model of primary blast traumatic brain injury. A compressed-air driven shock tube is used to expose in vitro mouse hippocampal slice cultures to a single shock wave. This is a simple and rapid protocol generating a reproducible brain tissue injury with a high throughput.

Un modello di romanzo In Vitro di ferita di cervello traumatica di scoppio

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

An Emerging Target Paradigm to Evoke Fast Visuomotor Responses on Human Upper Limb Muscles

To reach towards a seen object, visual information has to be transformed into motor commands. Visual information such as the object&#8217;s color, shape, and size are processed and integrated within numerous brain areas, then ultimately relayed to the motor periphery. In some instances, a reaction is needed as fast as possible. These fast visuomotor transformations, and their underlying neurological substrates, are poorly understood in humans as they have lacked a reliable biomarker. Stimulus-locked responses (SLRs) are short latency (&#60;100 ms) bursts of electromyographic (EMG) activity representing the first wave of muscle recruitment influenced by visual stimulus presentation. SLRs provide a quantifiable output of rapid visuomotor transformations, but SLRs have not been consistently observed in all subjects in past studies. Here we describe a new, behavioral paradigm featuring the sudden emergence of a moving target below an obstacle that consistently evokes robust SLRs. Human participants generated visually guided reaches toward or away from the emerging target using a robotic manipulandum while surface electrodes recorded EMG activity from the pectoralis major muscle. In comparison to previous studies that investigated SLRs using static stimuli, the SLRs evoked with this emerging target paradigm were larger, evolved earlier, and were present in all participants. Reach reaction times (RTs) were also expedited in the emerging target paradigm. This paradigm affords numerous opportunities for modification that could permit systematic study of the impact of various sensory, cognitive, and motor manipulations on fast visuomotor responses. Overall, our results demonstrate that an emerging target paradigm is capable of consistently and robustly evoking activity within a fast visuomotor system.

Presented here is a behavioral paradigm that elicits robust fast visuomotor responses on human upper limb muscles during visually guided reaches.

Un paradigma bersaglio emergente per evocare risposte visuomotor veloci sui muscoli degli arti superiori umani

To reach towards a seen object, visual information has to be transformed into motor commands. Visual information such as the object&#8217;s color, shape, ...