Le cellule della cresta neurale emigrano dalle pieghe neurali craniche negli embrioni o quando vengono poste in coltura. Ciò fornisce un metodo conveniente per isolare le cellule primarie della cresta neurale migratoria senza dissociazione cellulare. Mentre la migrazione della cresta neurale avviene tipicamente all'interno dell'ambiente embrionale tridimensionale, la cultura bidimensionale consente la visualizzazione e l'indagine dei processi correlati alla migrazione.
Sebbene esistano protocolli di coltura della piega neurale cranica, questo metodo richiede un allenamento e passaggi specifici dell'organismo. Questo video dimostra le tecniche per facilitare la preparazione riproducibile delle colture di pieghe neurali craniche di pulcino. I principianti spesso lottano con la dissezione e la placcatura delle pieghe neurali e la valutazione dei risultati della cultura.
Seguire le linee guida di dissezione e applicare l'analisi morfometrica qui descritta consente di ottenere risultati quantitativi coerenti. Per iniziare, posizionare le uova fecondate in posizione verticale all'interno di un'incubatrice umidificata a 38 gradi Celsius. Dopo aver rimosso le uova dall'incubatrice, disinfettare i gusci spruzzando accuratamente il 70% di etanolo e lasciandoli asciugare.
Per fissare e colorare le colture, utilizzare vetrini di copertura collocati in un piatto di coltura di tessuto multi-pozzetto e pipettare una soluzione sufficiente di fibronectina per coprire il fondo del pozzetto. Quindi, sostituire il coperchio e incubare la piastra con una soluzione di fibronectina in un incubatore umidificato a 38 gradi Celsius per almeno un'ora mentre si sezionano le pieghe neurali. Usa una pinza smussata per praticare un piccolo foro nel guscio da 1/4 a 1/3 della lunghezza dell'uovo.
Inserire con attenzione le pinze smussate nel piccolo foro, assicurandosi di non interrompere il tuorlo. Quindi, tagliare il guscio d'uovo intorno all'uovo, rimuovere la parte superiore del guscio d'uovo e posizionare l'embrione per l'isolamento. Preparare l'embrione usando delicatamente il bordo piatto di una pinza smussata chiusa per rimuovere l'albumina in eccesso sulla superficie del tuorlo che copre l'embrione.
Utilizzare una pinza per posizionare una cornice di supporto in carta da filtro sopra l'embrione, con l'embrione nella finestra del telaio. Premere delicatamente sulla carta da filtro per aderire al tuorlo. Tagliare intorno all'esterno del telaio della carta da filtro con le forbici da dissezione.
Usa una pinza o punte a forbice per afferrare il bordo del telaio e sollevare delicatamente l'embrione dal tuorlo. Posizionare l'embrione con il telaio di carta rivolto verso il basso in una capsula di Petri da 60 o 100 millilitri riempita con Ringer con streptococco a penna. Tenere il piatto di embrioni sul ghiaccio se li si raccoglie per un'applicazione a valle sensibile all'RNA o alle proteine.
Trasferire un embrione in un piatto pulito contenente la soluzione di streptococco di Ringer. Versare delicatamente l'embrione avanti e indietro per eliminare qualsiasi tuorlo che oscura la vista e scambiare la soluzione di streptococco di penna del Ringer o trasferirlo in un piatto fresco se diventa torbido. Posizionare l'embrione dorsale e inquadrare il lato verso l'alto sotto un microscopio da dissezione.
Lasciare l'embrione sul telaio di carta per tenerlo allungato e tenuto in posizione. Quindi, rimuovere la membrana vitellina, usando una pinza per esporre le pieghe neurali. Includere il tessuto caudale alle vescicole ottiche in espansione e rostrale al cervello posteriore, dove le costrizioni rombomeriche stanno appena iniziando a comparire.
Usando le forbici a molla, asportare accuratamente le pieghe neurali del mesencefalo. Fare attenzione ad asportare l'aspetto più dorsale della piega neurale con una contaminazione minima del tubo neurale e dell'ectoderma non neurale e trasferire le pieghe neurali in un piatto pulito contenente la soluzione di streptococco a penna di Ringer usando un pipettor P20 o una pipetta Pasteur di vetro sterile risciacquata con la soluzione di penna streptococco di Ringer tuorla. Conservare le pieghe raccolte sul ghiaccio mentre si sezionano ulteriori pieghe.
Dopo aver rimosso il piatto di coltura dall'incubatore, utilizzare un pipettor o una pipetta Pasteur per rimuovere la soluzione di fibronectina dai vetrini di copertura, dal piatto o dal pozzetto. Dopo aver risciacquato il substrato rivestito di fibronectina con la soluzione di streptococco a penna di Ringer, aggiungere un volume appropriato di terreno di coltura completo al piatto o al pozzetto. Per bloccare la plastica e impedire che il tessuto si attacchi, utilizzare un pipettatore P20 o P200 e sciacquare la punta della pipetta con la soluzione di streptococco a penna di Yolky Ringer.
Quindi, trasferire le pieghe neurali isolate verso il centro del vetrino di copertura rivestito di fibronectina, avendo cura di trasferire il meno possibile la soluzione di streptococco di Ringer. Dopo aver lasciato che gli espianti si depositino per 10-15 minuti, metterli in una camera umidificata a 38 gradi Celsius trasportando lentamente e con attenzione il piatto di coltura con pieghe neurali placcate. Rimuovere i terreni di coltura con una pipetta Pasteur e sciacquare i pozzetti con PBS sterilizzato con filtro.
Aggiungere il 4% di paraformaldeide e tenerlo su uno shaker a piattaforma per 15 minuti a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, rimuovere la paraformaldeide, sciacquare i pozzetti tre volte con PBS e aggiungere PBST contenente il 5% di siero. Ora, pipettare 30 microlitri di falloidina coniugata Oregon Green da 200 nanomolari su una superficie liscia per ogni vetrino di copertura.
Utilizzando un paio di pinze, rimuovere il vetrino di copertura dal PBST contenente il 5% di siero, assicurando l'orientamento delle cellule rivolte verso l'alto. Elimina il liquido in eccesso toccando brevemente il bordo del coperchio su un delicato tergicristallo. Posizionare delicatamente ogni lato della cellula di copertura verso il basso sulla goccia di falloidina diluita e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
Dopo il periodo di incubazione, sollevare il vetrino di copertura dalla soluzione colorante e rimetterlo nel piatto di coltura, capovolgendolo in modo che il lato cellulare sia verso l'alto. Assicurarsi di coprire il vetrino di copertura con PBST e posizionarlo su uno shaker a piattaforma per 10 minuti, mantenendo i vetrini di copertura coperti e al buio. Rimuovere il PBST e ripetere il lavaggio del coperchio due volte per un totale di tre lavaggi di 10 minuti.
Posizionare una goccia di supporto di montaggio su un vetrino da microscopio. Montare la cella di slittamento del coperchio con il lato rivolto verso il basso abbassando lentamente la linguetta del coperchio ad angolo sul supporto di montaggio per evitare di creare bolle e consentire al supporto di impostare prima dell'imaging. Infine, immaginate le celle colorate ed esportatele come file TIFF.
Le cellule della cresta neurale hanno iniziato ad emergere dagli espianti di piega neurale aderente entro tre o quattro ore dall'incubazione e la migrazione è stata completata dopo circa 20 ore. Le cellule della cresta neurale migratoria sono state etichettate utilizzando HNK-1 e la maggior parte delle cellule sembrava essere HNK-1 positiva. Le cellule della cresta neurale migrate sono state visualizzate colorando l'actina filamentosa con la falloidina.
Le immagini delle cellule colorate con falloidina sono state elaborate utilizzando ImageJ per produrre un'immagine di soglia in cui le cellule apparivano nere con uno sfondo bianco. L'immagine della soglia è stata analizzata e varie misurazioni visualizzate in grafici a barre contrastanti o grafici di violino. Ad esempio, l'area media delle 69 cellule analizzate era di circa 802,11 micrometri quadrati, che vanno da 60,27 a 2.664,53 micrometri quadrati.
La circolarità riflette la protrusività della cellula e varia da 0,101 a 0,875. I valori più bassi indicano una forma allungata, mentre un valore di uno indica un cerchio perfetto. La maggior parte delle celle mostrava una forma allungata, che è più facilmente visibile nella trama del violino.
Le cellule della cresta neurale migratoria in questo campo avevano un rapporto di aspetto medio di circa 2,13 e un rapporto di aspetto di uno indica una forma simmetrica. Un'attenta escissione e placcatura espiantata sono fondamentali per colture di successo. Lasciare che le pieghe neurali si depositino con il lato tagliato verso il basso per 10-15 minuti, quindi trasferirsi lentamente nell'incubatore per incoraggiare l'adesione.
Le variazioni di queste tecniche includono la manipolazione genetica transitoria prima della coltura e l'imaging time-lapse durante l'incubazione. Inoltre, questo protocollo consente la raccolta di popolazioni di cellule della cresta neurale premigratory e migratorie per l'analisi a livello omico.
