Gli autori ringraziano i membri del laboratorio Lwigale per la critica del manoscritto. SLG è supportato da una Ruth L. Kirschstein NRSA Fellowship dal National Eye Institute (F32 EY02167301). PYL è supportato dal National Eye Institute (EY018050).

1. Incubare pulcino e uova di quaglia allo stadio desiderato Per HH9 gli embrioni, i tempi di incubazione tipici variano da 29-33 ore a 38 ° C. 63 <ol><li> Lavare i detriti dalle uova con acqua tiepida. </li><li> Disporre uova di gallina sul vassoio orizzontale. Contrassegnare il lato rivolto verso l&#39;alto con matita, questo corrisponde alla regione in cui l&#39;embrione viene localizzato. Incubare le uova di quaglia fine smussata up. </li><li> Luogo in 38 ° C incubatore umidificato. Accendere funzione dondolo. </li></ol> 2. Preparare le uova per finestre e dissezione <ol><li> Rimuovere le uova da incubatrice, e sterilizzare le cime con il 70% di etanolo. E &#39;meglio spruzzare sul etanolo e pulirla velocemente con un tovagliolo di carta o Kimwipe per evitare l&#39;assorbimento di etanolo attraverso il guscio d&#39;uovo. </li><li> Luogo uovo di gallina su un portauovo individuale (usiamo una piastra di Petri foderato con asciugamani di carta piegati, ad esempio, &quot;Kimwipes&quot;). Utilizzando pinze AA, toccare un piccolo hole nella superficie superiore del guscio alla estremità appuntita dell&#39;uovo. </li><li> Rimuovere 1,5-3 ml di luce albumina dall&#39;uovo di pollo con un ago ipodermico 18 ½ G e siringa da 5 ml. È preferibile inserire l&#39;ago verticalmente nel foro, con lo smusso rivolto verso l&#39;estremità appuntita dell&#39;uovo (Figura 2A). In questo modo, quando l&#39;albumina è ritirato, vi è scarso rischio di danneggiare accidentalmente il tuorlo mediante aspirazione. Eliminare l&#39;albumina. Questo passaggio abbasserà il tuorlo e l&#39;uovo all&#39;interno dell&#39;embrione per consentire una finestra da aprire nel guscio d&#39;uovo. </li><li> Pulire il foro con il 70% di etanolo come descritto sopra e sigillare con nastro adesivo. È importante che il guscio circonda il foro è completamente privo di albumina e secco o l&#39;adesivo non sigillare. </li><li> Con le pinze AA, toccare un altro buco nella superficie marcata superiore dell&#39;uovo orizzontale, non proprio al vertice. Fate attenzione a non lasciare che le pinze andare troppo lontano con il guscio per evitare di danneggiare il tuorlo o embrione. </li><li> Inserire un lato delle pinze curve dell&#39;iride nel foro parallelo al guscio delle uova. Stringendo verso il basso il guscio, lavorando in un movimento circolare per rompere un ~ 2 cm di diametro finestra nel guscio dell&#39;uovo di gallina. Eliminare il guscio d&#39;uovo rimosso. In alternativa, coprire la superficie superiore dell&#39;uovo con nastro da imballaggio e utilizzare un paio di forbici per tagliare la finestra. Questo riduce al minimo la possibilità di detriti guscio cadere l&#39;uovo. L&#39;embrione dovrebbe apparire come un disco opaco in cima al tuorlo. Eliminare le uova non fecondate (identificati da una piccola macchia bianca sulla superficie di tuorlo, o assenza di Blastoderm). </li><li> Iniettare una piccola quantità di inchiostro di china (1:10 diluito in soluzione di Ringer sterile contenente &quot;Pen / Strep&quot; antibiotico: concentrazione finale di 100 pg / ml di penicillina e 100 pg / mL di streptomicina) sotto il Blastoderm per assistere staging l&#39;embrione. Utilizzare una siringa da 1 ml e 26 ½ ago ipodermico G, piegati a 45 ° rispetto alla base dell&#39;ago, con lo smusso rivolto verso l&#39;alto, in alternativa, uno may utilizzare una pipetta Pasteur di vetro tirato e pipettaggio apparato della bocca (indossare protezioni per gli occhi quando ci si piega ago ipodermico o rottura ago di vetro). Puntura la membrana tuorlo fuori del perimetro del Blastoderm e far scorrere la punta dell&#39;ago sotto l&#39;embrione, vicino alla superficie del tuorlo, ma non negli strati embrionali (Figura 2B). Iniettare solo l&#39;inchiostro sufficiente per delineare l&#39;embrione, poi accuratamente estrarre l&#39;ago (Figura 2C). Iniettare l&#39;inchiostro troppo può portare alla morte dell&#39;embrione. È importante non iniettare eventuali bolle d&#39;aria sotto l&#39;embrione, in quanto questo può essere una fonte di contaminazione. NB: Tutte soluzione di Ringer utilizzato in questa procedura è sterilizzato e contiene Pen / Strep come sopra definito. Fosfato sterile soluzione salina tamponata (PBS) è anche un&#39;alternativa accettabile per la soluzione di Ringer in tutte le fasi di questo protocollo. </li><li> Stadio l&#39;embrione in base alla Hamburger e Hamilton 63 e registrare la tappa sul guscio con inchiostro permanente o matita. Le fasi sono più valutati in base stereomicroscopy, con fibre ottiche &quot;a collo di cigno&quot;, sorgenti luminose che hanno un carico limitato di calore. </li><li> Applicare 2-3 gocce soluzione calda di Ringer sterile alla superficie dell&#39;embrione per prevenire la disidratazione e la contaminazione. Temporaneamente sigillare la finestra con parafilm allungato sopra la superficie dell&#39;uovo. </li><li> Ripetere i passaggi da 2,2-2,9 con tutte le uova di pollo prima di iniziare gli esperimenti di trapianto. </li><li> Dal momento che gli embrioni di quaglia sono utilizzate solo per i tessuti dei donatori, nei passaggi ovo 2,2-2,9 può essere omessa. Per la preparazione ex ovo donatori di embrioni, uova di quaglia sono incubate lato smussato e la sua apertura in questa regione con le pinze curve di rivelare l&#39;embrione. Dissezione con forbici, fare quattro tagli a forma di un quadrato attraverso la membrana vitellina e Blastoderm fuori l&#39;embrione (assicurarsi che tutti i tagli si incontrino). Utilizzando una pinza curva dell&#39;iride, prenda delicatamente un bordo di taglio e sollevare l&#39;embrione da l&#39;uovo e trasferirlo alla soluzione Ringers in una capsula di Petri. In alternativa, si può utilizzare la curvad iris pinza per sollevare l&#39;embrione escisso da sotto, o un cucchiaio o embrione pipetta di plastica tagliare la parte più larga del cilindro, può essere utilizzato per trasferire l&#39;embrione dall&#39;uovo. Rimuovere delicatamente la membrana vitellina con # 5 pinze. Raccogliere gli embrioni quaglia rimanenti come sopra, e scena sotto un microscopio da dissezione. </li></ol> 3. Preparare l&#39;embrione di accoglienza per ricevere l&#39;innesto <ol><li> Rimuovere parafilm dall&#39;host (chick) dell&#39;embrione e usando un ago di tungsteno appuntito o # 5 pinze, strappare un piccolo foro nella membrana vitellina alla regione desiderata del tubo neurale (Figura 3A). </li><li> Aggiungere una goccia di soluzione di Ringer per l&#39;embrione. Fare attenzione a mantenere l&#39;embrione completamente immerso in soluzione di Ringer durante tutto il procedimento per prevenire la disidratazione del tessuto. Mantenere aggiungendo gocce di soluzione di Ringer alla superficie dell&#39;embrione tramite pipetta se necessario. </li><li> Usando un ago di vetro tirato, con cura rendono rostrale e caUdal incisioni trasversali corrispondenti alla lunghezza e la regione di interesse nel tubo dorsale neurale. (Aghi vetro Tirato sono generati da tubi di vetro di silicio capillari che sono state tirate a caldo con un ago trazione apparato.) Per innesti unilaterali le incisioni deve estendersi al lume del tubo dorsale neurale, e per innesti bilaterali, rendono le incisioni tutta l&#39;intero tubo dorsale neurale. Poi tagliare bilaterale tra il tubo neurale dorsale e il mesoderma parassiale. </li><li> Accuratamente separare l&#39;espianto escisso dal tubo neurale poi rimuoverlo dall&#39;embrione aspirando in una micropipetta di vetro (Figura 3B). </li></ol> 4. Preparare il tessuto innesto donatore <ol><li> Scegliere una fase-abbinato embrione quaglia. Tenere premuto l&#39;embrione con le pinze AA, rimuovere la membrana vitellina, e accise uno di dimensioni simili regione del tubo neurale come descritto in precedenza (3,3-3,4) (Figura 3A&#39;-B &#39;). A seconda delle esigenze del vostro esperimento, questa regione può essere unregione complementare del tubo ospite (pulcino) neurale o da una regione diversa lungo l&#39;asse rostro-caudale. (NB: per i più grandi innesti regionali, tra cui completi innesti del tubo neurale, i ricercatori potrebbe voler aggiungere una digestione della proteasi in questa fase di rimuovere qualsiasi tessuto aderente dal tessuto mesenchimale donatore prima del trapianto, tuttavia, per i piccoli innesti dorsali del tubo neurale nelle fasi iniziali. , come è descritto qui, digestione proteasica non è necessaria in quanto il tubo neurale viene facilmente separato dal mesenchima adiacente mediante tecniche chirurgiche rigorosamente.) </li></ol> 5. Innesto il tessuto <ol><li> Aspirare il espianto donatore in una micropipetta di vetro contenente soluzione di Ringer. Fare attenzione a non introdurre bolle nella pipetta. </li><li> Trasferire la espianto adiacente alla regione asportata dell&#39;ospite pulcino. Utilizzando ago di vetro tirato, orientare l&#39;espianto e delicatamente guidare nella regione ablato (Figura 3C). </li><li> Aggiungere con cautela alcune gocce di soluzione di Ringerper l&#39;embrione per prevenire la disidratazione. Fare attenzione a non far cadere liquido direttamente sul sito del trapianto in quanto ciò potrebbe staccare l&#39;innesto. </li><li> Chiudere la finestra con nastro da imballaggio. Assicurarsi che il nastro sigilla l&#39;intera regione dell&#39;uovo finestra. Ciò impedisce la disidratazione e la contaminazione dell&#39;embrione durante la successiva incubazione. </li><li> Ritorna l&#39;uovo alla incubatrice fino allo stadio desiderato. Assicurarsi che la funzione &quot;rocking&quot; è disattivata, mentre incubando le chimere. Le uova possono essere leggermente ruotato a mano due volte al giorno come questo può aumentare la loro redditività, se le fasi successive di sviluppo sono presi di mira. </li></ol> 6. Preparare gli embrioni chimerici per il sezionamento <ol><li> Al endpoint sperimentale, tagliare il nastro che copre la finestra con le forbici sottili. </li><li> Afferrare il bordo della Blastoderm con pinza curva dell&#39;iride (più facile a che fare con seghettato punte), poi tagliare l&#39;embrione dal tuorlo con 4 tagli di grandi dimensioni al di fuori dei confini del Blastoderm. </li&gt; <li> Trasferire l&#39;embrione di una capsula Petri contenente soluzione di Ringer. Fare attenzione a minimizzare l&#39;esposizione dell&#39;embrione di aria per evitare la disidratazione del tessuto. </li><li> In stereomicroscopia, separare delicatamente la membrana vitellina dal Blastoderm utilizzando # 5 pinze. </li><li> Cura organizzare l&#39;embrione nel piatto in modo che l&#39;embrione è nello stesso orientamento come era nell&#39;uovo, con membrane che circondano distesi. </li><li> Utilizzare dissezione aghi realizzati da 64 fili di tungsteno per rimuovere in modo pulito il Blastoderm circostante dall&#39;embrione disponendo l&#39;ago al confine dell&#39;embrione e tessuti extraembrionali, con la lunghezza del filo di tungsteno parallelo al fondo del piatto. Con un movimento delicato sega per tagliare i tessuti. </li><li> Rimuovere con cura la membrana amniotica con # 5 pinze. A questo punto si può, né vuole ulteriormente analizzare la regione di tuo interesse, o lasciare il tutto embrione. </li><li> Trasferire l&#39;embrione di ghiaccio solfo freddo 4%ormaldehyde e rock per una notte a 4 ° C. </li><li> Preparare i campioni e incorporare per il sezionamento crio-o paraffina. </li></ol> Tracciare il tessuto trapiantato all&#39;interno dell&#39;embrione host. Ci sono diverse tecniche per l&#39;identificazione dei tessuti quaglia all&#39;interno di un embrione di pollo, compresa l&#39;individuazione di quaglia nucleoli mediante colorazione ematossilina (nuclei di quaglia sono molto grandi, inclusioni di colorazione più scura rispetto a nuclei pulcino), il Feulgen-Rossenbeck reazione, acridina-arancio o biz-benzammide macchia in combinazione con la microscopia elettronica, o per le quaglie immunomarcatura specifici antigeni 3,47,65,66. Qui usiamo l&#39;antigene QCPN e standard intero-mount o sezione tecniche di immunofluorescenza per identificare le cellule della cresta neurale di quaglia in quaglia-chick chimere (Figura 4). Questa tecnica offre la massima flessibilità nel disegno sperimentale, come la immunofluorescenza QCPN possono anche essere combinati con altri anticorpi per identificare cellule differenziate derivate da tessuto del donatore (quaglie). Utilizzare Standard whole-mount o tecniche di immunofluorescenza sezione di etichettare quaglia cellule derivate in chimere. 7. Risultati rappresentativi Una immagine rappresentativa della regione innestata del tubo neurale, dopo 6h di ri-incubazione (per HH11) mostra prevede l&#39;incorporazione della innestato donatore (quaglie) tessuto nell&#39;ospite (chick) del tubo neurale (Figura 4A). Gli embrioni che mostrano integrazione incompleta del trapianto, o lo sviluppo asimmetrico della regione cranica o somiti dopo reincubation deve essere eliminata. Sezione attraverso la regione innestato a HH11 CNC show etichettati con HNK-1 migrazione lateralmente dal tubo neurale. Quail cellule che contribuiscono al flusso NCC migratorio, e al tubo neurale, sono chiaramente etichettati con QCPN (Figura 4B). Nelle fasi successive, quaglia NCC-cellule derivate possono essere ricondotti alla loro tessuto bersaglio finale. QCPN cellule marcate si alternano all&#39;interno del mesenchima dell&#39;embrione di pollodel processo mascellare a E5 (Figura 4C). L&#39;anticorpo QCPN possono essere facilmente combinati con altri anticorpi per esaminare la differenziazione della quaglia derivati ​​NCC per l&#39;ambiente host. Quail neuroni trigeminali NCC-derivati ​​sensoriali sono etichettati da QCPN e Tuj1 anticorpi (Figura 4D). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3622/3622fig1.jpg" /> Figura 1. Panoramica della procedura sperimentale e strumenti necessari. A) Host (chick) e donatori (quaglie) gli embrioni devono essere stage abbinato. Per etichettare il flusso di NCC che contribuisce alla ganglio trigeminale e maxillo-mandibolare regione HH9 è l&#39;ideale. Al HH9, il tubo neurale sta cominciando a chiudere nella regione rostrale, ma non è ancora completamente sigillato. La linea grigia nei diagrammi rappresenta la linea mediana del tubo di chiusura neurale. Le linee tratteggiate bianche indicano le linee di taglio per asportare una regione del mesencefalo lato destro del tubo neurale dall&#39;host e donatore embryos. La regione escisse dell&#39;embrione host viene scartato e il tessuto trapiantato nel donatore per generare l&#39;embrione chimerico. B) gli strumenti necessari sono: a) siringa da 5 ml con 18 ½ ago ipodermico G, b) siringa da 1 ml con 26 ½ piegato ipodermico G ago a 45 °, c), inchiostro di china, d) cancella il nastro di imballaggio, e) pipetta di vetro con la bocca pipettaggio apparato, f) 60 mm-Petri, g) AA pinze, h) curve pinza dentata iris con punte, i) # 5 pinze, forbici sottili j), k) affilato filo di tungsteno, l) tirato ago di vetro, m) parafilm quadrati. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3622/3622fig2.jpg" /> Figura 2. La preparazione delle uova e degli embrioni. A) Sezione trasversale di un uovo, compreso punto di inserimento ideale di 18 ½ ago ipodermico G per il ritiro della luce albumina. B) Dopo aver estratto ~ 3 ml di albumina luce, il tuorlo e abbassa dell&#39;embrione all&#39;interno dell&#39;uovo, permettendo ai ricercatori di tagliare una &quot;finestra&quot; (frecce) in tguscio d&#39;uovo che per accedere al embrione. Inchiostro di china, diluito 1:10 in soluzione di Ringer sterile, può essere iniettato sotto il Blastoderm per fornire contrasto per un facile messa in scena degli embrioni. C) di embrioni di pollo dopo l&#39;inchiostrazione. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3622/3622fig3.jpg" /> Figura 3. Schema ed esempi di scena HH 9 embrioni di donatori e di accoglienza in ogni fase della procedura di innesto. A) embrione ospite Chick. Le linee tratteggiate nel diagramma indicano dove la membrana vitellina dovrebbe essere strappato per accedere al cranio per l&#39;innesto. Una volta strappato il lembo triangolare di membrana vitellina dovrebbe essere sbucciata caudalmente. Box in immagine indica inserto utilizzato (BC). A &#39;) Quail embrione donatore. L&#39;immagine è di embrioni prelevati da donatori uovo e messo in piastra di Petri per la dissezione del tessuto trapiantato. Box in immagine indica inserto utilizzato in (B &#39;). Le linee tratteggiate in diagramma schematico (A &#39;) indicano dove la vitellina e membrane tuorlo deve essere tagliato in modo da rimuovere tha embrione dall&#39;uovo. B) embrione Host con la regione del mesencefalo unilaterale del tubo neurale espunto (frecce bianche) in attesa di trapianto. La linea tratteggiata in schema indica dove i tagli dovrebbero essere di asportare il tubo neurale nella regione del mesencefalo. B &#39;) embrione donatore con la dorsale del tessuto asportato del tubo neurale graft (innesto di tessuto indicato da frecce nere). Linea tratteggiata in figura indica dove i tagli dovrebbero essere in embrione quaglia ad accisa dei tessuti del donatore per il trapianto unilaterale della regione mesencefalo del tubo neurale. C) embrione chimerico dopo il trapianto di quaglia espianto dorsale del tubo neurale nella regione del mesencefalo pulcino. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3622/3622fig4.jpg" /> Figura 4. Immunofluorescenza rilevare quaglia specifico QCPN antigene nucleare del donatore-derivate cellule embrionali chimerico. A) Whole-mount immagine di HH11 chimera (innestato a HH9) che mostra QCPN colorazione in rosso, e HNK-1 colorazione (un marcatore di migrazione CNC) inverde. Ingrandimento 10X, vista dorsale. B) Sezione trasversale dell&#39;embrione (A), mostrando QCPN cellule positive quaglia derivate nel tubo neurale e migratorio NCC co-macchiata di HNK-1 (verde). Ingrandimento 40X. C) Sezione trasversale attraverso il processo mascellare chimera E5 (incubate per tre giorni dopo graft), mostrando QCPN-positivi NCC-cellule derivate (rosso) che sono migrati dalla regione innestato del tubo neurale alla loro posizione finale nell&#39;embrione. Ingrandimento 10X. D) il punto attraverso il contributo E5 chimera mostrando di quaglia derivato NCC al ganglio trigeminale (rosso) e differenziazione in neuroni TuJ1-positivi (verde). Ingrandimento 40X. *, CNC, MP, processo mascellare; NT, tubo neurale, TG, ganglio trigeminale.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;innesto di quaglia tubo neurale in embrioni di pollo di accoglienza qui descritto è una tecnica semplice e poco costoso per il tracciamento sottopopolazioni specifiche di migrazione NCC provenienti da diverse regioni lungo l&#39;asse rostro-caudale 21,67-69. Questa tecnica sfrutta la facilità di accesso alle embrioni di uccelli (rispetto a embrioni mammiferi) e possono essere combinati con altre tecniche, come l&#39;ablazione del tessuto, l&#39;iniezione di molecole inibitrici, manipolazione genetica ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Chick uova </td><td> Various - usiamo Texas A &amp; M University Poultry Science Department, TX. </td><td></td></tr><tr><td> Uova di quaglia </td><td> Various - usiamo Egg Ozarks Company, MO. </td><td></td></tr><tr><td> Egg incubatore (Digital Readout 1502 Sportsman Incubator w / Umidità 110-120 Volt AC) </td><td> <a href="http://www.poultrysupply.com" target="_blank">www.poultrysupply.com</a> </td><td> 1502 </td></tr><tr><td> Dumont AA pinze, Inox con verniciatura epossidica </td><td> Strumenti di Scienza Fine </td><td> 11210-10 </td></tr><tr><td> Nastro adesivo </td><td> Qualsiasi negozio di forniture per ufficio </td><td></td></tr><tr><td> Iris curvo pinza </td><td> Strumenti di Scienza Fine </td><td> 11065-07 </td></tr><tr><td> Iondia inchiostro </td><td> Qualsiasi negozio di forniture per l&#39;arte </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep (penicillina, streptomicina) Soluzione </td><td> VWR International </td><td> 101447-068 </td></tr><tr><td> Cancella nastro di imballaggio </td><td> Qualsiasi negozio di forniture per ufficio </td><td></td></tr><tr><td> Needle apparecchi tirando </td><td> Narashige, Giappone </td><td> PE-21 </td></tr><tr><td> Aghi di vetro tirato, fatto 1,5-1,8 x 100mm tubo di vetro borosilicato capillare </td><td> Kimble chase </td><td> 34500 99 </td></tr><tr><td> Tirato pipetta di vetro, realizzata da 5 ¾ &quot;pipetta Pasteur </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-6A </td></tr><tr><td> Apparecchi Mouth pipetta (tubo aspiratore per il montaggio calibrato pipetta microcapillare) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5177-52A </td></tr><tr><td> Dumont # 5 pinze </td><td> Strumenti di Scienza Fine </td><td> 11251-30 </td></tr><tr><td> Bottegsten filo, diametro 0,1 millimetri </td><td> VWR International </td><td> AA10404-H2 </td></tr><tr><td> Porta aghi (nichelato titolare pin) </td><td> Strumenti di Scienza Fine </td><td> 26018-17 </td></tr><tr><td> QCPN antisiero </td><td> Developmental Studies ibridomi Bank, University of Iowa </td><td> QCPN </td></tr><tr><td> Alexa Fluor anticorpo secondario (per esempio, Alexa Fluor 594 capra anti-topo IgG1) </td><td> Invitrogen </td><td> A21125 </td></tr><tr><td> Soluzione di Ringer (2L): <ul><li> 14.4g NaCl </li><li> 0.34g CaCl 2 </li><li> 0.74g KCl </li><li> 0.230g Na 2 HPO 4 </li><li> 0,04 g KH 2 PO 4 </li><li> ddh 2 O a 2L </li><li> Filtro e autoclave </li></ul></td><td> Tutti i reagenti da Fisher Scientific </td><td><ul><li> 7647-14-5 </li><li> 10043-52-4 </li><li> 7447-40-7 </li><li> 7558-79-4 </li><li> 7778-77-0 </li></ul></td></tr></tbody></table>

analysis of neural crest migration and differentiation by cross-species transplantation

Embrioni di uccelli fornire una piattaforma unica per studiare molti processi vertebrati sviluppo, a causa della facile accesso degli embrioni all&#39;interno dell&#39;uovo. Chimerici embrioni di uccelli, in cui è trapianto di tessuto donatore quaglie in un embrione di pollo in ovo, combinano la potenza di etichettatura indelebile genetica di popolazioni cellulari con la facilità di manipolazione presentata dalla embrione aviaria. Quail-pulcino chimere sono uno strumento classico per il tracciamento migratori cellule della cresta neurale (CNC) 1-3. CNC sono una popolazione transitoria migratoria delle cellule nell&#39;embrione, che sono originari della regione dorsale del 4 in via di sviluppo del tubo neurale. Sono sottoposte a uno di transizione epitelio mesenchimale e successivamente migrare verso altre regioni dell&#39;embrione, dove si differenziano in vari tipi cellulari tra cui la cartilagine 5-13, 11,14-20 melanociti, neuroni e glia 21-32. I CNC sono multipotenti, e il loro destino finale è influenzato da 1) la regione del tubo neurale in cui hanno origine lungo l&#39;asse rostro-caudale dell&#39;embrione 11,33-37, 2) i segnali provenienti da cellule vicine mentre migrano 38-44, e 3) il microambiente della loro definitiva destinazione all&#39;interno dell&#39;embrione 45,46. Tracing queste cellule dal loro punto di origine al tubo neurale, alla loro posizione finale e il destino all&#39;interno dell&#39;embrione, fornisce informazioni importanti sui processi evolutivi che regolano patterning e l&#39;organogenesi. Il trapianto di regioni complementari del tubo neurale del donatore (omotopi innesto) o di diverse regioni del tubo neurale del donatore (trapianto eterotopico) può rivelare differenze di pre-specifiche della NCC lungo l&#39;asse rostro-caudale 2,47. Questa tecnica può essere ulteriormente adattata per trapiantare un compartimento unilaterale del tubo neurale, in modo tale che un lato è derivato da tessuto donatore, e resti lato controlaterale imperturbato nell&#39;embrione ospite, yiElding un controllo interno all&#39;interno del campione stesso 2,47. Può anche essere adattato per il trapianto di segmenti del cervello in embrioni successive, dopo HH10, quando il tubo anteriore neurale è chiuso 47. Qui riportiamo le tecniche per la generazione di quaglia-chick chimere Con il trapianto del tubo neurale, che consentono di rintracciare CNC migratori provenienti da un segmento discreta del tubo neurale. Specie-specifica etichettatura dei donatori cellule derivate con la quaglia anticorpo specifico QCPN 48-56 consente al ricercatore di distinguere donatore e cellule ospiti al punto finale sperimentale. Questa tecnica è molto semplice, poco costoso, e ha molte applicazioni, tra cui il destino-mapping, linea cellulare l&#39;analisi e l&#39;individuazione pre-patterning eventi lungo l&#39;asse rostro-caudale 45. A causa della facilità di accesso al embrione aviaria, la quaglia-pulcino tecnica innesto può essere combinato con altre manipolazioni, inclusi ma non limitati a ablazione lente 40, l&#39;iniezione di molecole inibitrici 57,58 o manipolazione genetica mediante elettroporazione di plasmidi di espressione 59-61, per identificare la risposta di particolari flussi migratori di CNC alle perturbazioni nel programma di sviluppo dell&#39;embrione. Inoltre, questa tecnica innesto può anche essere usato per generare altri embrioni interspecifiche chimerici come quaglia anatra chimere per studiare contributo al NCC morfogenesi craniofacciale, o mouse-pulcino chimere di combinare la potenza di topo genetica con la facilità di manipolazione dell&#39;embrione aviaria 62.

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Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Un approccio per l&#39;analisi della migrazione e il destino finale di aviaria cellule della cresta neurale a quaglie-chick embrioni chimera è descritta. Questo metodo è una tecnica semplice e diretto per il tracciamento cellule della cresta neurale durante la migrazione e la differenziazione che sono altrimenti difficili da distinguere all&#39;interno di un embrione di pollo non manipolata.

Analisi della migrazione cresta neurale e la differenziazione delle specie da Cross-trapianto

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

22.7K Views.  Rice University. Un approccio per l'analisi della migrazione e il destino finale di aviaria cellule della cresta neurale a quaglie-chick embrioni chimera è descritta. Questo metodo è una tecnica semplice e diretto per il tracciamento cellule della cresta neurale durante la migrazione e la differenziazione che sono altrimenti difficili da distinguere all'interno di un embrione di pollo non manipolata.

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Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent progenitor cells to be an integral part of the neural crest1. Phenotypically, neural crest stem cells (NCSC) are defined by simultaneously expressing p75 (low-affine nerve growth factor receptor, LNGFR) and SOX10 during their migration from the neural crest2,3,4,5. These progenitor cells can differentiate into smooth muscle cells, chromaffin cells, neurons and glial cells, as well as melanocytes, cartilage and bone6,7,8,9. To cultivate NCSC in vitro, a special neural crest stem cell medium (NCSCM) is required10. The most complex part of the NCSCM is the preparation of chick embryo extract (CEE) representing an essential source of growth factors for the NCSC as well as for other types of neural explants. Other NCSCM ingredients beside CEE are commercially available. Producing CCE using laboratory standard equipment it is of high importance to know about the challenging details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes. In this protocol we describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE.

To cultivate neural crest stem cells (NCSC) in vitro, a special medium (NCSCM) is required. Essential part of NCSCM is chick embryo extract (CEE). We here describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE, including details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes.

Produzione di estratto di Chick dell&#39;embrione per la coltivazione delle cellule della cresta neurale Murine staminali

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

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Neuroscienze

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

Fisiologici, caratterizzazione morfologica e neurochimica dei neuroni modulati Movimenti

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

L&#39;isolamento e la coltura di cellule staminali neurali Crest di follicoli dei capelli umani

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

T-maze Forced Alternation and Left-right Discrimination Tasks for Assessing Working and Reference Memory in Mice

Forced alternation and left-right discrimination tasks using the T-maze have been widely used to assess working and reference memory, respectively, in rodents. In our laboratory, we evaluated the two types of memory in more than 30 strains of genetically engineered mice using the automated version of this apparatus. Here, we present the modified T-maze apparatus operated by a computer with a video-tracking system and our protocols in a movie format. The T-maze apparatus consists of runways partitioned off by sliding doors that can automatically open downward, each with a start box, a T-shaped alley, two boxes with automatic pellet dispensers at one side of the box, and two L-shaped alleys. Each L-shaped alley is connected to the start box so that mice can return to the start box, which excludes the effects of experimenter handling on mouse behavior. This apparatus also has an advantage that in vivo microdialysis, in vivo electrophysiology, and optogenetics techniques can be performed during T-maze performance because the doors are designed to go down into the floor. In this movie article, we describe T-maze tasks using the automated apparatus and the T-maze performance of &alpha;-CaMKII+/- mice, which are reported to show working memory deficits in the eight-arm radial maze task. Our data indicated that &alpha;-CaMKII+/- mice showed a working memory deficit, but no impairment of reference memory, and are consistent with previous findings using the eight-arm radial maze task, which supports the validity of our protocol. In addition, our data indicate that mutants tended to exhibit reversal learning deficits, suggesting that &alpha;-CaMKII deficiency causes reduced behavioral flexibility. Thus, the T-maze test using the modified automatic apparatus is useful for assessing working and reference memory and behavioral flexibility in mice.

This article presents the protocol of T-maze tests using a modified automated apparatus for assessing the learning and memory functions in mice.

T-labirinto alternanza forzata e sinistra-destra Attività discriminazione per la Valutazione di lavoro e la memoria di riferimento nel Mice

Forced alternation and left-right discrimination tasks using the T-maze have been widely used to assess working and reference memory, respectively, in ...

Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after undergoing an epithelial-mesenchymal transition 1,2. Following EMT, NCCs migrate large distances along stereotypic pathways until they reach their targets. NCCs differentiate into a vast array of cell types including neurons, glia, melanocytes, and chromaffin cells 1-3. The ability of NCCs to reach and recognize their proper target locations is foundational for the appropriate formation of all structures containing trunk NCC-derived components 3. Elucidating the mechanisms of guidance for trunk NCC migration has therefore been a matter of great significance. Numerous molecules have been demonstrated to guide NCC migration 4. For instance, trunk NCCs are known to be repelled by negative guidance cues such as Semaphorin, Ephrin, and Slit ligands 5-8. However, not until recently have any chemoattractants of trunk NCCs been identified 9. 
Conventional in vitro approaches to studying the chemotactic behavior of adherent cells work best with immortalized, homogenously distributed cells, but are more challenging to apply to certain primary stem cell cultures that initially lack a homogenous distribution and rapidly differentiate (such as NCCs). One approach to homogenize the distribution of trunk NCCs for chemotaxis studies is to isolate trunk NCCs from primary NT explant cultures, then lift and replate them to be almost 100% confluent. However, this plating approach requires substantial amounts of time and effort to explant enough cells, is harsh, and distributes trunk NCCs in a dissimilar manner to that found in in vivo conditions. 
Here, we report an in vitro approach that is able to evaluate chemotaxis and other migratory responses of trunk NCCs without requiring a homogenous cell distribution. This technique utilizes time-lapse imaging of primary, unperturbed trunk NCCs inside a modified Zigmond chamber (a standard Zigmond chamber is described elsewhere10). By exposing trunk NCCs at the periphery of the culture to a chemotactant gradient that is perpendicular to their predicted natural directionality, alterations in migratory polarity induced by the applied chemotactant gradient can be detected. This technique is inexpensive, requires the culturing of only two NT explants per replicate treatment, avoids harsh cell lifting (such as trypsinization), leaves trunk NCCs in a more similar distribution to in vivo conditions, cuts down the amount of time between explantation and experimentation (which likely reduces the risk of differentiation), and allows time-lapse evaluation of numerous migratory characteristics.

An approach to analyze the migration of explanted cells (trunk neural crest cells) is described. This method is inexpensive, gentle, and capable of distinguishing chemotaxis from both chemokinesis and other influences on migratory polarity such as those derived from cell-cell interactions within the primary trunk neural crest cell culture.

Analisi della migrazione cresta neurale cellulare Trunk con un Modified Zigmond Assay Camera

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

Rilevamento di ipossia microregionale nella corteccia cerebrale di topo Imaging a due fotoni di fluorescenza endogena NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Riproducibile nervo sciatico Crush mouse e successiva valutazione da parte della Rigenerazione intera analisi Muscle Monte

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da Embryonic Murine tubo neurale

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

The discovery of neural stem and progenitor cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult mammalian brain has led to a body of research aimed at utilizing the multipotent and proliferative properties of these cells for the development of neuroregenerative strategies. A critical step for the success of such strategies is the mobilization of NPCs toward a lesion site following exogenous transplantation or to enhance the response of the endogenous precursors that are found in the periventricular region of the CNS. Accordingly, it is essential to understand the mechanisms that promote, guide, and enhance NPC migration. Our work focuses on the utilization of direct current electric fields (dcEFs) to promote and direct NPC migration - a phenomenon known as galvanotaxis. Endogenous physiological electric fields function as critical cues for cell migration during normal development and wound repair. Pharmacological disruption of the trans-neural tube potential in axolotl embryos causes severe developmental malformations1. In the context of wound healing, the rate of repair of wounded cornea is directly correlated with the magnitude of the epithelial wound potential that arises after injury, as shown by pharmacological enhancement or disruption of this dcEF2-3. We have demonstrated that adult subependymal NPCs undergo rapid and directed cathodal migration in vitro when exposed to an externally applied dcEF. In this protocol we describe our lab's techniques for creating a simple and effective galvanotaxis assay for high-resolution, long-term observation of directed cell body translocation (migration) on a single-cell level. This assay would be suitable for investigating the mechanisms that regulate dcEF transduction into cellular motility through the use of transgenic or knockout mice, short interfering RNA, or specific receptor agonists/antagonists.

In this protocol we demonstrate how to construct custom chambers that permit the application of a direct current electric field to enable time-lapse imaging of adult brain derived neural precursor cell translocation during galvanotaxis.

Un test Galvanotaxis Analisi della Cinetica precursori neurali migrazione cellulare in un campo applicato esternamente diretto Corrente elettrica

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout the developing vertebrate embryo. In addition to providing peripheral glia and neurons, NCC generate melanocytes as well as most of the cranio-facial skeleton. NCC migration and differentiation is controlled by a combination of their axial origin along the neural tube and their exposure to regionally distinct extracellular cues. Such contribution of extracellular ligands is especially evident during the formation of the enteric nervous system (ENS), a complex interconnected network of neural ganglia that locally controls (among other things) gut muscle movement and intestinal motility. Most of the ENS is derived from a small initial pool of NCC that undertake a long journey in order to colonize - in a rostral to caudal fashion - the entire length of the prospective gut. Among several signaling pathways known to influence enteric NCC colonization, GDNF/RET signaling is recognized as the most important. Indeed, spatiotemporally controlled secretion of the RET ligand GDNF by the gut mesenchyme is chiefly responsible for the attraction and guidance of RET-expressing enteric NCC to and within the embryonic gut. Here, we describe an ex vivo cell migration assay, making use of a transgenic mouse line possessing fluorescently labeled NCC, which allows precise quantification of enteric NCC migration potential in the presence of various growth factors, including GDNF.

We present an ex vivo cell migration assay that allows precise quantification of enteric neural crest cell migration potential in the presence of various growth factors.

Un saggio di migrazione cellulare quantitativa per murini enterici neurali Progenitori

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...